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活性酸素種(ROS)産生蛍光タンパク質
Evrogen社 光感受性赤色蛍光タンパク質 KillerRed 関連製品
ミトコンドリア局在ベクターに続き、新たに細胞膜局在ベクターpKillerRed-memをラインアップ

特長

  1. 遺伝学的に完全にコードされた初の光感受性物質
  2. 細胞外の化学物質または酸素以外の補因子が不必要
  3. 540-580nmの緑色光によってROS産生が誘導可能
  4. in vivoにおける目的タンパク質の正確な光分子機能不活性化が可能
  5. 緑色光による選択的な細胞死誘導が可能

KillerRed概要

タンパク質名称 KillerRed
由来 Anthomedusae
クラゲ
蛍光色
励起波長λEx (nm) 585
蛍光波長λEm (nm) 610
分子吸光係数 (M-1cm-1 45,000
蛍光収率 (φ) 0.25
輝度*1 11.3
pKa 5.1
分子量 (kDa) 約 26.6
構造 ダイマー

励起・蛍光スペクトル

KillerRedの励起・蛍光スペクトルの測定。
   ●励起スペクトル : 蛍光スペクトル=585 nm : 610 nm
   ●青色バーと緑色バーは相対的な光毒性効果を示している。
      ・青色バー : 460-490nmの光照射後の生細胞数の減少率を1.0とした。
      ・緑色バー : 540-580nmの光照射後の生細胞数の減少率は、460-490nmと比較して21.2倍であった。

      → 青色と比較して、緑色光によって効率よく細胞死が誘導されることを確認。

緑色光による細胞死の誘導

KillerRed発現E. coli の光誘導細胞死の経時変化。
   ・ Control : 非形質転換体のE. coli 。
   ・ KillerRed : pKillerRed-B vector導入E. coli。   
   → KillerRed発現E. coli は光照射後20分で96%が死滅。

KillerRedのミトコンドリア局在によるアポトーシス誘導のモニタリング

HeLa細胞のミトコンドリアにおいてpKillerRed-dMito vectorを発現させ、細胞質にてTurboGFPを発現させた共焦点画像。
   pKillerRed-dMito vectorをHeLa細胞に導入し515-560nmの緑色光を照射
   a : 10分間の緑色光(515-560nm, 7 W/cm2)照射後の細胞
   → ミトコンドリアにおいて赤色蛍光の消失が確認。
   照射後60分間は細胞形態を保持していたが、ROSの影響によってアポトーシス特有の細胞形態の異常が確認され、細胞が死滅。
   b : 緑色光未照射細
   → 正常に成育。

光分子不活性化(Chromophore-assisted light inactivation:CALI)解析

KillerRedとβ-galactosidase(β-gal)の融合タンパク質を発現するE. coliを用いたCALI解析。
   ・in vitro解析(上図) : 融合タンパク質発現E. colii の抽出液に白色光を25分照射
   → 抽出液のβ-gal活性は、5分で50.0%が失活し、25分で99.4%が失活。一方、KillerRedと融合させていないβ-gal は酵素活性を維持。
   → KillerRedと融合させたタンパク質を、in vivoで特異的に不活性化させることが可能。

   ・in vivo解析(データ未掲載) :融合タンパク質発現E. coliに、540-580nmの緑色光を30分照射 
   → 細胞中でβ-gal が不活性化。   

KillerRedを用いた応用CALI解析

<1, 膜結合タンパク質の機能解析例>

※注. PHドメイン...細胞内膜のリン脂質に特異的に結合

KillerRedとphospholipase C δ1のPH(Pleckstrin Homology)ドメインとEGFPの融合タンパク質(EGFP-PH-KillerRed)を発現する293Tを用いたCALI解析
    
   ・緑色光照射なし
   → b : 融合タンパク質のPHドメインによる細胞内膜での局在を確認。
   ・515-560 nm, 7 W/cm2の緑色光を10秒照射
   → a, c : KillerRedのROS産生によってPHドメインが不活性化。
   → 融合タンパク質が細胞内膜から遊離し細胞質へ局在したのを確認。
   → PHドメインが細胞内膜に特異的に結合・局在する現象をin vivoでリアルタイムに解析することが可能。
    

<2, KillerRed膜局在ベクター(pKillerRed-mem vector)を用いたHeLa細胞の光誘導細胞死の解析例>

KillerRed膜局在HeLa細胞を用いた光誘導細胞死の解析
(スケールバー:10um)

細胞質:TurboGFP発現
細胞膜:KillerRed発現(pKillerRed-mem vectorによる)

515-560 nm, 7 W/cm2の緑色光を10分照射
→ 10〜30分以内に緑色光照射細胞が死滅
→ pKillerRed-mem vectorの使用により、ミトコンドリア局在ベクター(pKillerRed-dMito vector)によるKillerRed発現と比較して、より効果的に細胞死の誘導が可能であることが確認された。

<3, ゼブラフィッシュを用いたin vivoにおける光誘導細胞死の解析例>

光誘導細胞死

ゼブラフィッシュの受精卵にGFP発現ベクターとKillerRed細胞膜局在発現ベクター(pKillerRed-mem vector)を導入した後、
ふ化後48時間の幼魚に緑色光を照射し、FITCフィルター(緑色蛍光用)とTRITCフィルター(赤色蛍光用)で、上記部位を解析した。

→ 緑色光照射後20分以内に筋細胞の形態が変形し徐々に衰退する現象を確認した。

[製品内容]

■哺乳動物細胞用, C末端融合タイプ

■哺乳動物細胞用, N末端融合タイプ

■バクテリア用, N末端融合タイプ   

■ミトコンドリア局在解析用

■細胞膜局在解析用 NEW !!

コードNo. 
メーカーコード 
製品名 
コドン 
ユーセージ 
レポーター 
蛍光色 
容量 
希望納入価格(円) 
551-85141
FP961 
pKillerRed-C vector 
(哺乳動物細胞用, N末端融合タイプ) 
Humanized 
KillerRed 
赤 
20μg 
84,000 
558-85151
FP962 
pKillerRed-N vector 
(哺乳動物細胞用, N末端融合タイプ) 
555-85161
FP963 
pKillerRed-B vector 
(バクテリア用, N末端融合タイプ) 
552-85171
FP964 
pKillerRed-dMito vector 
(ミトコンドリア局在解析用) 
518-02551
FP966 
NEW !!
pKillerRed-mem vector 
559-85181
FPK01 
Cell-Killer vector set 
(pTurboGFP-N、pKillerRed-dMito vecter 
の2種ベクターセット) 
KillerRed 
TurboGFP 

 緑 
1set 
135,000 
515-02561
FPK02 
NEW !!
Membrane-Killer vector set 
(pTurboGFP-N、pKillerRed-mem vecter の2種ベクターセット) 
KillerRed 
TurboGFP 

 緑 
1set 
135,000 
512-02571
FPK03 
NEW !!
Double-Killer vector set 
(pTurboGFP-N、pKillerRed-dMito、pKillerRed-mem vecter の3種ベクターセット) 
KillerRed 
TurboGFP 

 緑 
1set 
165,000 

*表示している希望納入価格は「本体価格のみ」で消費税等は含まれておりません。
*表示している希望納入価格は2012年12月の価格です。最新価格は「製品検索」からコードNo.で検索してご確認ください。

参考文献

・ Bulina M. E., et. al. A genetically encoded photosensitizer.: Nat Biotechnol. 24, 95 (2006)

詳しい製品情報はEvrogen社ホームページにてご参照下さい。

ライセンス

KillerRed関連製品に関するライセンスは以下URLを御参照下さい。
http://www.evrogen.com/license_Ph.shtml

掲載されている試薬は、試験・研究の目的のみに使用されるものであり、「医薬品」、「食品」、「家庭用品」などとしては使用できません。
表示している希望納入価格は「本体価格のみ」で消費税等は含まれておりません。
表示している希望納入価格は本記事掲載時点の価格です。最新価格は「製品検索」からコードNo.で検索してご確認ください。

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