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Argonaute2タンパク質に結合している低分子RNAの精製キット
マウス、ラット、ハムスターなどのmicroRNA精製に使用実績あり。
microRNA Isolation Kit, Mouse Ago2

microRNA Isolation Kit, Mouse Ago2は、高品質の抗マウスAgo2モノクローナル抗体を利用した免疫沈降法により、microRNA-Ago2複合体を回収し、microRNAを特異的に精製するキットです。
従来のmicroRNAの精製法（変性ポリアクリルアミドゲル抽出）では、rRNAやtRNAの分解産物が多く含まれてしまい、microRNAのクローニング効率を著しく低下させていました。
本キットは、Ago2に取り込まれたmicroRNAを高純度に含むRNA画分を調製でき、従来精製法に比べ簡便かつ特異的にmicroRNAの精製が可能です。

• 特長
• 原理
• キット操作概要　
• キット内容
• 従来法との比較
• microRNA Isolation Kit, Mouse Ago2 使用例　　

1. マウス細胞株のmicroRNA精製
2. 精製microRNA画分のクローニング
3. マウス組織のmicroRNA精製

• 抗マウスAgo2モノクローナル抗体反応性
• 価格表

特長

1) マウス、ラット、ハムスターAgo2の免疫沈降が可能
2) Ago2タンパク質に結合したmicroRNAを高純度に精製可能
3) rRNAやtRNAの分解産物や他のsmall RNAなどの夾雑が少ない
4)精製したmicroRNA画分をクローニングやマイクロアレイに応用可能

原理

キット操作概要

キット内容 （10 回用）　

(1) Anti Mouse Ago2 Antibody Beads Solution　500μL×1 本
(2) Cell Lysis Solution　50mL×1 本
(3) Elution Solution　　　　　500μL×1 本
(4) Ethachinmate　　　　　　30μL×1 本
(5) 3 mol/L Sodium Acetate　　　400μL×1 本

従来法との比較

microRNA Isolation Kit, Mouse Ago2 使用例

1)げっ歯類細胞株のmicroRNA精製

図1． 図. 1　培養細胞株からのmiRNA精製　microRNAIsolation Kit, Mouse Ago2を用いて、ヒト培養細胞（HeLa）及びげっ歯類培養細胞株（P388D1, CHO, PC-12）から精
製したmicroRNA画分をUrea-PAGEにより分離し、銀染色（CLEAR STAIN Ag, 316-03961）によって検出した。その結果、3種のげっ歯類細胞株特異的にmicroRNA精製が可能であることが示された。使用細胞数は5×10⁶cells相当。

2)精製microRNA画分のクローニング

. rRNA……rRNA 分解断片のcDNA
. tRNA……tRNA 分解断片のcDNA
. Unknowns……ゲノム配列に一致しないcDNA
. Others ……… ゲノム配列に一致し、miRBase に未登録のcDNA

図. 2 P388D1細胞から精製したmicroRNA画分のクローニングmicroRNAIsolation Kit, Mouse Ago2を用い、マウス細胞株P388D1細胞からmicroRNA画分を精製した後、microRNACloning Kit
Wako　を使用してsmall RNAのクローニング及びその分布を解析した。またランダムに選抜した87クローンの塩基配列を解読し，データベース( SangermiRNARegistry )と照合した。結果、87クローン中82クローン（全体の94.3%）がmicroRNAであることを確認した。82クローンの内訳は表1に示した。

3)マウス組織からmicroRNAmicroRNA精製精製

下記プロトコールにより、マウス組織（肺、肝臓、脳）からmicroRNA画分を精製した。

【マウス組織抽出液の調整】

マウス凍結組織約25mg
↓←1mL Cell Lysis Solution
破砕（テフロンホモジナイザー使用）
↓15分間　氷上で静置。
↓遠心分離（14,500rpmまたは20,000×g, 4℃, 20分）

上清を回収する。
↓
0.45μmのフィルターでろ過する。
↓
新しい2.0mLチューブに回収する。（細胞溶解液)

【抗体ビーズの使用前洗浄】

1) Anti Mouse Ago2 Antibody Beads Solution 50μLを1.5mLマイクロ遠心チューブに移す。
2) 4℃、5,600rpm(3,000 ×g)で30秒間遠心分離し、上清を除く。
3) ビーズペレットをCell Lysis Solution 1mLで懸濁し、4℃、5,600rpm(3,000 ×g)で30秒間遠心分離後、上清を除く。（洗浄済みビーズ溶液）

【microRNA画分の精製】

a) 抗原-抗体反応
1)　前洗浄済みAnti Mouse Ago2 Antibody Beads Solutionに、1mL 細胞溶解液（組織25mg由来） を添加しボルテックスミキサーで懸濁する。
2)　4℃でローテーターにより転倒混和し、3時間抗原抗体反応を行う。3)　4℃、5,600rpm(3,000 ×g)で30秒間遠心分離し、上清を除く。

b) 反応後の洗浄
1) ビーズペレットにCell Lysis Solution 1mLを添加し、ボルテックスミキサーで懸濁する。
2) 4℃、5,600rpm(3,000 ×g)で30秒間遠心分離し、上清を除く。
3) 1)〜2)の操作をさらに2回繰り返す。洗浄操作は計3回行う。

ｃ） 抗原溶出とmicroRNAの精製
1) ビーズペレットにElution Solution（注1）50μLを添加し、ボルテックスミキサーで懸濁する。
2) 4℃、5,600rpm(3,000 ×g)で30秒間遠心分離し、上清を1.5mLマイクロ遠心チューブに移す。（注２）
3) 滅菌水350μL、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール (25：24：1) 400μLを添加し、ボルテックスミキサーで懸濁する。
4) 室温、14,500rpm(20,000 ×g)で10分間遠心分離する。
5) 上層（水層）を1.5mLマイクロ遠心チューブに移し（注3）、クロロホルム400μLを添加し、ボルテックスミキサーで混合する。
6) 室温、14,500rpm(20,000 ×g)で10分間遠心分離する。
7) 上層（水層）を1.5mLマイクロ遠心チューブに移し、Ethachinmate 3μL、3 mol/L Sodium Acetate 40μL、99.5% エタノール1mLを添加し、ボルテックスミキサーで混合する。
8) 4℃、14,500rpm(20,000 ×g)で15分間遠心分離し、上清を除く。
9) 沈殿に70% エタノール 溶液1mLを添加し、ボルテックスミキサーで混合する。
10) 4℃、14,500rpm(20,000 ×g)で10分間遠心分離し、上清を除く。
11) チューブの蓋を開けて室温で20分間放置し、ペレットを風乾する。
12) ペレットを滅菌水、またはTEバッファー10μLに溶解する。（注4）

注１．Elution Solutionは冷蔵保存により成分が析出していますので、使用前に室温に戻し、ボルテックスミキサーで攪拌後、成分が完全に溶解していることを確認してから使用してください。
注2．上清をマイクロピペッターで吸う際に、ビーズペレットを吸わないように注意してください。ビーズに非特異吸着した核酸が混入する場合があります。
注3．上層（水層）をマイクロピペッターで吸う際に、中間層を吸わないように注意してください。
注4．溶解後のサンプルは-80℃で保存してください。

図. 3　マウス組織からのmicroRNA精製マウスから採取した肺,肝臓及び脳組織において、microRNAIsolation Kit, Mouse Ago2によるmiRNA精製を行った。その後、精製したmicroRNA画分についてUrea-PAGEによる分離及び銀染色による核酸検出を行った。結果、肺,肝臓及び脳組織からmicroRNAが精製できることが示された。

抗マウスAgo2モノクローナル抗体（2D4）の反応性

図. 4　NIH/3T3（マウス）、SCC-131（ラット）、CHO（ハムスター）
の細胞溶解液に、本品5 μg を固相化した10% Protein G slurry を20 μl 添加し、免疫沈降を行った。得られた免疫沈降画分をSDS-PAGE に供し、銀染色及び本品を一次抗体として用いたウエスタンブロットを行った。その結果、マウスだけでなく、ラットとハムスターにおいても100kDa 付近に内在性のAGO2のバンドが確認された。使用細胞数は5×10⁶相当。ウエスタンブロットの一次抗体希釈倍率は1/1,000。

価格表

＊Anti Human AGO2, Monoclonal AntibodyはコードNo.を変更いたしました。旧コードNo.　016-20861（50μL）　→　新コードNo.　011-22033（50μL）。
＊希望納入価格には消費税等が含まれておりません。