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高効率 ・ 正確 ・ 簡便なアダプターライゲーションを実現
microRNA Cloning Kit Wako

microRNA Cloning Kit wakoは、熱による不活性化が容易なエビ由来アルカリホスファターゼ（SAP）の脱りん酸反応と、一本鎖DNAおよび一本鎖RNAを高効率に連結可能な耐熱性リガーゼ（別売）によるアダプターライゲーション反応とを、同一の溶液中で反応させることが可能な和光純薬工独自の緩衝液を用います。これによって、簡便かつ高効率なアダプターライゲーションが可能になり、microRNAを容易にcDNA化することが可能になりました。

• 特長
　　　
• キット内容
• 操作概要図
• 従来のクローニング法との比較と改善点
• 使用例　＜HeLa 細胞に発現しているmicroRNAのクローニング＞
• 価格
• 関連製品

特長

　 1)　耐熱性リガーゼによる高効率で正確なアダプターライゲーションが可能
　 2)　ヘアピン型microRNAのクローニングに最適
　 3)　RNA操作が少なく1.5 日でmicroRNAをコードするcDNAが作製可能

キット内容

(1) SAP　　 16μl　
(2) 5×SAP Buffer　　 64μl
(3) 40×Ligation Buffer　　 16μl
(4) RNase Inhibitor　　 16μl
(5) 10mmol/L MnCl2　　 16μl
(6) Reverse Transcriptase 　　8μl
(7) 10×RT Buffer　　 16μl
(8) dNTP Mixture　　 112μl
(9) 0.5 mol/L EDTA, pH 8.0　　 16μl　
(10) 1mol/L Tris-HCl, pH 7.5　　 160μl
(11) Ethachinmate　　 24μl
(12) 10mol/L Ammonium Acetate　 960μl
(13) 3’ Adaptor(50pmol/μL)　　 8μl
(14) 5’ Adaptor(50pmol/μL)　　 8μl
(15) RT Primer(50pmol/μL)　　 8μl
(16) 5’ PCR Primer(50pmol/μL)　　 16μl
(17) 3’ PCR Primer(50pmol/μL) 　　16μl
(18) Control RNA(30ng/μL) 　　8μl

本キットには、耐熱性リガーゼ、およびPCR用の耐熱性DNAポリメラーゼは含まれておりません。

microRNA Cloning Kit Ｗakoには、別売の一本鎖DNAリガーゼ, 耐熱性, 組換え体, 溶液（コードNo. 292-65101, 298-65103）を必ずご使用ください。本酵素は1回のクローニングにつき、20 unitsを使用します。Buffer組成、および反応条件はすべてこの酵素に最適化しております。本酵素は、ATP依存性でDNAとRNAの両方のライゲーション反応に使用できます。また、最適反応温度が55〜65℃ですので、T4 RNA リガーゼと比較してmicroRNAとアダプターのライゲーション効率を大幅に改善できます。

操作概要図

・エビ由来アルカリホスファターゼ、耐熱性リガーゼ（別売）による反応が1チューブで可能です。
・3'アダプターをライゲーション後の、逆転写反応後すぐに0.2mol/L NaOHで加水分解するため、RNA操作が少なくてすみます。
・一連のアダプターライゲーション中に、変性ポリアクリルアミドゲルを一度も使用しないため、操作性がアップしました。

これらによって、クローニング可能なcDNAが1.5日で合成可能です。

※ 本キットには、耐熱性リガーゼ、およびPCR用の耐熱性DNAポリメラーゼは含まれておりません。

従来のクローニング法との比較と改善点

使用例　＜HeLa 細胞に発現しているmicroRNAのクローニング実績＞

98%以上のクローニング効率
70%以上のmicroRNA存在率

1)　HeLa細胞（1×10⁷ cells） より ISOGENにてTotal RNAを抽出。
2)　Total RNA からSmallRNA画分をカラム抽出し、15% 変性アクリルアミドゲルにて200nt以下のSmallRNA画分を電気泳動後、20〜23nt付近を切り出し抽出。
3)　microRNA Cloning Kit WakoでmicroRNAをコードするcDNAを合成し、T-ベクターにクローニング。
4)　大腸菌へT-ベクターを導入し、抗生物質を含むLB寒天培地にて形質転換体を96クローン選抜。
　　 （本実験では青白コロニー選抜は行っておりません）
5)　コロニー PCR にて60〜63bp付近にcDNAの挿入を確認（図.1）。

図.1　TAクローニングにより得られた大腸菌のコロニーPCR
得られた96クローンのうち、95クローンで挿入断片が確認でき、98%以上の高確率でクローニングが可能であった。

図.2　本キットでクローニングしたsmall RNA
得られた96クローンよりプラスミドを抽出し、塩基配列を解析した後、データベース ( Sanger miRNA Registry )と照合したところ、96クローン中、70クローン（全体の73%）がmicroRNAであることを確認した（図.2）。これにより、非常に高効率にmicroRNAのクローニングが可能であることが示唆された。
70クローンの内訳は表.1をご参照ください。

表1.　上記グラフ記載の70クローンの内訳

価格

関連製品

microRNA Cloning Kit Wakoは特許出願中です。（平成19年10月1日現在）

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● 希望納入価格には消費税等が含まれておりません。