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microRNA ‘‘特異的’’ 精製キット
microRNA Isolation Kit, Human Ago2

microRNA Isolation Kit, Human Ago2は、高品質の抗ヒトAgo2モノクローナル抗体を利用した免疫沈降法により、microRNA-Ago2複合体を回収し、microRNAを特異的に精製するキットです。
従来のmicroRNAの精製法（変性ポリアクリルアミドゲル抽出）では、rRNAやtRNAの分解産物が多く含まれてしまい、microRNAのクローニング効率を著しく低下させていました。
本キットは、Ago2に取り込まれたmicroRNAを高純度に含むRNA画分を調製でき、従来精製法に比べ簡便かつ特異的にmicroRNAの精製が可能です。

• 特長
　　　
• 原理
• キット操作概要
• キット内容
• 従来法との比較
• microRNA Isolation Kit, Human Ago2 使用例

1. ヒト細胞株のmicroRNA精製
2. 精製microRNA画分のクローニング（追加データ！！）
3. ヒト組織のmicroRNA精製（追加データ！！）
4. 精製microRNA画分のマイクロアレイ解析（追加データ！！）
   

• 抗ヒトAgo2モノクローナル抗体の特異性
• 価格表（マウスAGO2抗体などの新製品追加！！）

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特長

1) 高効率にmicroRNAを精製可能
2) 特異性に優れた抗ヒトAgo2モノクローナル抗体を使用
3) 非特異的タンパク質の吸着が少ない高性能ビーズを使用
4) microRNAのクローニングに応用可能

原理

キット操作概要

キット内容 （10 回用）　

(1) Anti Human Ago2 Antibody Beads Solution　　　500μL×1 本
(2) Cell Lysis Solution　　　 50mL×1 本
(3) Elution Solution　　　 500μL×1 本
(4) Ethachinmate　　　30μL×1 本
(5) 3 mol/L Sodium Acetate　　　 400μL×1 本

従来法との比較

microRNA Isolation Kit, Human Ago2 使用例

1)ヒト細胞株のmicroRNA精製

図1． microRNA Isolation Kit, Human Ago2を用いて、ヒト培養細胞株3 種類（HeLa、HepG2、HEK293）、およびマウス培養細胞株（P388D1）から精製したmicroRNA 画分をUrea-PAGE によって検出した。その結果、ヒト培養細胞から特異的にmicroRNA が精製できた。使用細胞数は5×10⁶ 相当。

2)精製microRNA画分のクローニング

. rRNA……rRNA 分解断片のcDNA
. tRNA……tRNA 分解断片のcDNA

. Unknowns……ゲノム配列に一致しないcDNA
. Others ……… ゲノム配列に一致し、miRBase に未登録のcDNA

図2． microRNA Isolation Kit, Human Ago2 により、HeLa 細胞から精製したmicroRNA 画分をもちいてmicroRNA Cloning
Kit Wako でクローニングし、small RNA の分布を解析した。ランダムに選抜した95 クローンからプラスミドを抽出し、塩基配
列を解析した後，データベース（Sanger miRBase）と照合したところ、95 クローン中89 クローン（全体の93.7%）が
microRNA であることを確認した。89 クローンの内訳は表1を参照。

3)ヒト組織のmicroRNA精製
下記プロトコールにより、ヒト組織（Liver, Testis）からmicroRNA画分を精製した。

【ヒト組織抽出液の調整】

ヒト凍結組織約50mg（Liver, Testis）
↓←1mL Cell Lysis Solution
破砕（テフロンホモジナイザー使用）
↓←1mL Cell Lysis Solution
15分間　氷上で静置。
↓遠心分離（14,500rpmまたは20,000×g, 4℃, 20分）
上清を回収する。
↓
0.45μmのフィルターでろ過する。
↓
新しい2.0mLチューブに回収する。（細胞溶解液)

【抗体ビーズの使用前洗浄】

1) Anti Human Ago2 Antibody Beads Solution 50μLを1.5mLマイクロ遠心チューブに移す。
2) 4℃、5,600rpm(3,000 ×g)で30秒間遠心分離し、上清を除く。
3) ビーズペレットをCell Lysis Solution 1mLで懸濁し、4℃、5,600rpm(3,000 ×g)で30秒間遠心分離後、上清を除く。（洗浄済みビーズ溶液）

【microRNA画分の精製】

a) 抗原-抗体反応
1)　前洗浄済みAnti Human Ago2 Antibody Beads Solutionに、1mL 細胞溶解液（組織25mg由来） を添加しボルテックスミキサーで懸濁する。
2)　4℃でローテーターにより転倒混和し、3時間抗原抗体反応を行う。
3)　4℃、5,600rpm(3,000 ×g)で30秒間遠心分離し、上清を除く。

b) 反応後の洗浄
1) ビーズペレットにCell Lysis Solution 1mLを添加し、ボルテックスミキサーで懸濁する。
2) 4℃、5,600rpm(3,000 ×g)で30秒間遠心分離し、上清を除く。
3) 1)〜2)の操作をさらに2回繰り返す。洗浄操作は計3回行う。

ｃ） 抗原溶出とmicroRNAの精製
1) ビーズペレットにElution Solution（注1）50μLを添加し、ボルテックスミキサーで懸濁する。
2) 4℃、5,600rpm(3,000 ×g)で30秒間遠心分離し、上清を1.5mLマイクロ遠心チューブに移す。（注２）
3) 滅菌水350μL、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール (25：24：1) 400μLを添加し、ボルテックスミキサーで懸濁する。
4) 室温、14,500rpm(20,000 ×g)で10分間遠心分離する。
5) 上層（水層）を1.5mLマイクロ遠心チューブに移し（注3）、クロロホルム400μLを添加し、ボルテックスミキサーで混合する。
6) 室温、14,500rpm(20,000 ×g)で10分間遠心分離する。
7) 上層（水層）を1.5mLマイクロ遠心チューブに移し、Ethachinmate 3μL、3 mol/L Sodium Acetate 40μL、99.5% エタノール1mLを添加し、ボルテックスミキサーで混合する。
8) 4℃、14,500rpm(20,000 ×g)で15分間遠心分離し、上清を除く。
9) 沈殿に70% エタノール 溶液1mLを添加し、ボルテックスミキサーで混合する。
10) 4℃、14,500rpm(20,000 ×g)で10分間遠心分離し、上清を除く。
11) チューブの蓋を開けて室温で20分間放置し、ペレットを風乾する。
12) ペレットを滅菌水、またはTEバッファー10μLに溶解する。（注4）

注１．Elution Solutionは冷蔵保存により成分が析出していますので、使用前に室温に戻し、ボルテックスミキサーで攪拌後、成分が完全に溶解していることを確認してから使用してください。
注2．上清をマイクロピペッターで吸う際に、ビーズペレットを吸わないように注意してください。ビーズに非特異吸着した核酸が混入する場合があります。
注3．上層（水層）をマイクロピペッターで吸う際に、中間層を吸わないように注意してください。
注4.　溶解後のサンプルは-80℃で保存してください。

Lane1: Single strand RNA (22nt), 1ng
Lane2: Liver lysate.
Lane3: Testic lysate.

図3． microRNA Isolation Kit, Human Ago2を用いて、ヒト組織（Liver, Testis）から精製したmicroRNA 画分をUrea-PAGE によって検出した。スタートの組織使用量は50mgで、最終の細胞溶解液2mLを得た。そのうち1mLを免疫沈降反応に使用し、最終のRNA画分量を10μLに調製した。そのうちの5μLをUrea-PAGE に供した。

4)精製microRNA画分のマイクロアレイ解析

【方法】

HeLa細胞 (1×10^5〜1×10^7 cells)から「microRNA Isolation Kit, Human Ago2」を使用してmicroRNA-Ago2複合体を回収した後、添付プロトコルに従ってmicroRNAを精製、「"3D-Gene®"Human miRNA Oligo chip (東レ株式会社)」にて解析した。

【解析データ】

<銀染色における電気泳動データの検出状況>

<検出スポットのスキャン画像>

microRNA Isolation Kit, Human Ago2にて精製・回収されたmicroRNAを、高感度検出に優れている"3D-Gene®:"Human miRNA Oligo chipにて解析したところ、銀染色では検出が難しかった105個の細胞数でも300種類以上のmicroRNAが検出された。

細胞数に関しては106個以上の系において、Total RNAを使用する系で検出されにくい成熟microRNAが濃度依存的に検出された。

本結果から、濃縮キットと高感度DNAチップを組み合わせることでmicroRNAの研究における新たな機能解析が可能となることが示唆された。

価格表

＊Anti Human AGO2, Monoclonal AntibodyはコードNo.を変更いたしました。旧コードNo.　016-20861（50μL）　→　新コードNo.　011-22033（50μL）。
＊希望納入価格には消費税等が含まれておりません。

● 本文に収載しております試薬は、試験・研究の目的にのみ使用されるもので、「医療品」、「食品」、「家庭用品」などとして使用できません。
● 希望納入価格には消費税等が含まれておりません。

抗ヒトAgo2モノクローナル抗体の特異性

注･･･この実験結果はmicroRNA Isolation Kit, Human Ago2を使用したものではありません。

図. 4　抗ヒトAgo2モノクローナル抗体を用いて、ヒト培養細胞株4種類（HeLa、HepG2、HEK293、THP-1）、およびマウス培養細胞株（P388D1）から免疫沈降法により取得したタンパク質を、SDS-PAGEおよびWestern Blotにより検出した。ヒト培養細胞から特異的にAgo2タンパク質が回収でき、マウスAgo2には反応せずヒトAgo2特異的であることを確認した。各細胞株の細胞数は5×10⁶相当。

参考文献

■　抗ヒトAGO2, モノクローナル抗体（4G8）に関する参考文献

1）Miyoshi, K. et al. : Methods Mol Biol, 442, 29- 43（2008）.
2) 和光純薬時報, 74(4), 2-4(2006) .

■　AGOファミリータンパク質に関する参考文献

1） Fire, A. et al. : Nature, 391 , 806 - 811（1998）.
2） Gil, J. and Esteban, M. : Apoptosis, 5 , 107 - 114（2000）.
3） Elbashir, S. M. et al. : Nature, 411 , 494 - 498（2001）.
4） Dykxhoorn, D. M. and Lieberman, J. : Cell, 126 , 231 - 235（2006）.
5） Gregory, R. I. et al. : Cell, 123, 631- 640（2005）.
6） Rand, T. A. et al. : Cell, 123, 621 - 629（2005）.
7） Tomari, H. and Zamore, P. D. : Genes Dev., 19 , 517 - 529（2005）.
8） Hammond, S. M. : FEBS Letter, 579 , 5822 -5829（2005）.
9） Ambros, V. : Nature, 431 , 350 - 355（2004）.
10） Liu, J. et al. : Nature Cell Biol., 7, 1261- 1266（2005）
11） Liu, J. et al. : Science, 305 , 1437 - 1441（2004）.
12） Carmell, M. A. et al. : Genes Dev., 16 , 2733 -2742（2002）.
13） Yuan, Y-R. et al. : Mol. Cell, 19, 405- 419（2005）.
14） Song, J-J. et al. : Science, 305, 1026- 1032（2004）.
15） Miyoshi, K. et al. : Genes Dev., 19 , 2837 -2848（2005）.
16） Saito, K. et al. : Genes Dev., Epub Aug 1（2006）.