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新規アフィニティー分子によるエクソソーム精製キット
MagCapture™
Exosome Isolation Kit PS

本キットは、ホスファチジルセリン(PS)に結合するタンパク質と磁気ビーズを利用した新規アフィニティー法(PS アフィニティー法)により、PS を膜表面に有するエクソソームや他の細胞外小胞を高純度かつ高効率で簡便に単離することができます。また、10,000 × g 遠心分離を行った上清をサンプルに用いることで、より高純度にエクソソームを取得することができます。

さらに、本キットは金属イオン依存的に細胞外小胞を捕捉するため、キレート剤により中性条件下でインタクトな状態の細胞外小胞を溶出することができ、取得した細胞外小胞を、電子顕微鏡解析、ナノ粒子トラッキング解析、投与実験、構成分子(タンパク質、脂質、核酸など)の解析など様々なアプリケーションに利用することができます。


リンク関係


MagCapture™ Exosome Isolation Kit PSについてのアンケート

MagCapture™ Exosome Isolation Kit PSをご利用いただいたお客様からの幅広いご意見を、性能をより一層向上させるために役立てたいと考えております。
つきましては、下記アンケートにご協力いただけますようお願い申し上げます。
なお、実験が上手くいかなかった等ご不明な点がある場合、問[9]からお気軽にお問い合わせください。
内容を確認後、担当者よりご連絡いたします。

アンケートフォームはこちら

膜表面のホスファチジルセリン(PS)に対するアフィニティー法

アフィニティー法

ホスファチジルセリン(PS)結合分子を用いて細胞外小胞を金属イオン依存的に捕捉した後、キレート剤により溶出します。

MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS 特長

新規アフィニティー
精製法採用

PSアフィニティー分子による回収※
低バックグラウンド
キレート剤により中性条件下でマイルドに溶出

※抗体による従来アフィニティー精製法よりもエクソソームが 高収量であることを確認しています。

高純度・インタクトエクソソームを単離

超遠心分離不要

マグネティックビーズによる操作性アップ
最適化されたプロトコール

高い実験再現性


他の精製方法との比較
方法 純度 エクソソーム回収量 インタクト粒子の取得
MagCapture™ (PSアフィニティー法) ■■■
超遠心分離法 ■■
ポリマー沈殿法 × ■■■
表面抗原アフィニティー法(抗体使用) ×
対象サンプル:細胞培養上清、血清、血漿、尿など



コードNo. 品 名 容 量 希望納入価格(円)
299-77603 refrigerator MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS 2回用*1 20,000
293-77601 10回用*1 80,000

*1 使用した磁気ビーズを4回まで再生利用可能です。バッファー類も十分量同梱されています。同一サンプルからの繰り返し抽出 やコンタミネーションしないケースの場合、最大50回使用可能な製品となっています。ご検討下さい。

血清・血漿・尿サンプルから精製した細胞外小胞の解析

ヒト血清から単離したエクソソームの収量比較

ヒト血清サンプル 1mL から本キット、超遠心分離法および表面抗原に対する抗体アフィニティー法によりエクソソームを回収し、ウェスタンブロット(抗CD9抗体、抗CD63抗体)により検出を行った。

ヒト血清から単離したエクソソームの収量比較 レーン1.:超遠心分離法
レーン2.:MagCapture™
レーン3.:A社 Exosome抽出キット(CD9)
レーン4.:A社 Exosome抽出キット(CD63)
レーン5.:A社 Exosome抽出キット(CD81)
レーン6.:A社 Exosome抽出キット(CD9, CD63, CD81, EpCAM抗体ビーズ混合)
■WBのデータについて
各サンプル結果は、150μLの血清サンプルに相当します。
抽出物(100μL)から15μL抜き取り、4×SDSサンプルバッファーを5μL添加し、全量アプライしました。

MagCapture™ は、超遠心分離や抗体を用いたアフィニティー法よりもエクソソームの回収率が高い


ヒト EDTA 血漿サンプルからのエクソソームの単離

EDTA 血漿サンプル、EDTA 血漿(限界濾過でバッファー交換)、ヒト血清サンプル各 1mL から本キットによりエクソソームを回収し、ウェスタンブロット(抗 Flotillin2 抗体)により検出を行った。

ヒト血清から単離したエクソソームの収量比較 レーン1.:EDTA 血漿
レーン2.:EDTA 血漿(限外ろ過でバッファー交換)
レーン3.:血清
■検出抗体
抗 Flotillin-2 マウスモノクローナル抗体(29/Flotillin-2),
BD Biosciences 社

■使用サンプル量
各 1mL

■WBのデータについて
各サンプル結果は、150μLの血清サンプルに相当します。
抽出物(100μL)から15μL抜き取り、4×SDSサンプルバッファーを5μL添加し、全量アプライしました。

限外ろ過でバッファー交換をすることでより効率よくエクソソームを回収できる


ヒト尿サンプルから単離したエクソソームの収量比較

ヒト尿サンプル 1mL から本キット、ポリマー沈殿法、超遠心分離法によりエクソソームを回収し、ウェスタンブロット(抗 CD9 抗体)により検出を行った。


マーカータンパク質回収量比較 粒子径比較

レーン1:ポリマー沈殿法
レーン2:超遠心分離法
レーン3:PS アフィニティー法



■検出抗体
 抗 CD9 ウサギポリクローナル抗体
 System Biosciences 社

■使用サンプル量
 各 1mL

■WB のデータについて
 各サンプル結果は、150µL の尿サンプルに相当します。
 抽出物(100µL)から 15µL 抜き取り、
 4 × SDS サンプルバッファーを5µL 添加し、
 全量アプライしました。

Size Distribution:
 Mean: 176 +/- 1.6nm
 Mode: 117 +/- 4.5nm
 SD: 96 +/- 5.8nm
Total Concentration:
 155.52 +/- 9.35 particles/frame
 18.76 +/- 1.17 E8 particles/ml
Size Distribution:
 Mean: 191 +/- 9.4nm
 Mode: 113 +/- 2.8nm
 SD: 88 +/- 7.4nm
Total Concentration:
 21.43 +/- 1.83 particles/frame
 2.37 +/- 0.21 E8 particles/ml
Size Distribution:
 Mean: 107 +/- 1.2nm
 Mode: 86 +/- 1.2nm
 SD: 42 +/- 1.0nm
Total Concentration:
 106.96 +/- 2.83 particles/frame
 12.12 +/- 0.31 E8 particles/ml

尿サンプルからもエクソソームを高純度に回収することができた

従来の沈殿法との性能比較実験

K562(ヒト慢性骨髄性白血病)細胞培養上清(無血清培地または10%Exosome-depleted FBS添加培地)から本キット、超遠心分離法およびポリマー沈殿法を用いてエクソソームを回収し、回収量および純度を比較した。


MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS
遠心分離(10,000×g, 30分間)前処理したK562細胞培養上清(無血清培地または10%Exosome-depleted FBS添加培地)1mLからキットプロトコール(反応時間:3時間)に従ってエクソソームを回収した。


超遠心分離法
遠心分離(10,000×g, 30分間)前処理したK562細胞培養上清サンプル(無血清培地または10%Exosome-depleted FBS添加培地)10mLから超遠心分離(110,000×g, 70分間)し、沈殿をTBSで懸濁後、再び超遠心分離(110,000×g, 70分間)した沈殿画分を回収した。


ポリマー沈殿法
遠心分離(10,000×g, 30分間)前処理したK562細胞培養上清(無血清培地または10%Exosome-depleted FBS添加培地)1mLから市販のA社製品を用いて製品プロトコール(静置時間:終夜)に従いエクソソームを回収した。

取得エクソソームの電子顕微鏡解析およびNTA(ナノサイト)比較

K562細胞培養上清サンプル(無血清培地)から本キット、超遠心分離法、ポリマー沈殿法によって回収したエクソソーム画分の粒子径をナノサイトLM-10を用いて測定した。また、回収したエクソソーム画分(2〜4×1010particles)を終濃度2%パラホルムアルデヒドで固定化し、電子顕微鏡にて解析した。

取得エクソソームの電子顕微鏡解析およびNTA(ナノサイト)比較

電子顕微鏡画像 データ提供元:金沢大学 医学系 華山教授、大阪大学 iFReC 中井先生

MagCapture™ は 100nm 前後の粒子がたくさん回収でき、電子顕微鏡でも多くの細胞外小胞が確認できた

K562細胞培養上清(無血清培地)からの回収量と純度の比較

K562細胞培養上清(無血清培地)から本キット、超遠心分離法、ポリマー沈殿法で回収したサンプルを電気泳動した後、銀染色およびウェスタンブロット(抗CD63抗体、抗Lamp-1抗体、抗Flotillin-2抗体)により検出を行った。

K562細胞培養上清(無血清培地)からの回収量と純度の比較

MagCapture™ は、エクソソーム回収率が高く夾雑タンパク質が最も少ないため純度と回収量のバランスが最も良い

K562細胞培養上清(10%FBS添加培地)からの回収量と純度の比較

K562細胞培養上清(10%Exosome-depleted FBS添加培地)から本キット、超遠心分離法、ポリマー沈殿法で回収したサンプルを電気泳動した後、銀染色およびウェスタンブロット(抗CD63抗体、抗Lamp-1抗体、抗Flotillin-2抗体)により検出を行った。また、各回収画分をMASS解析し、同定した全ペプチドのうちK562細胞に由来するヒトペプチドの割合を比較した(培地に添加したFBSに由来するウシタンパク質凝集体が混入するほどヒト由来ペプチドの割合は低下する)。

K562細胞培養上清(10%FBS添加培地)からの回収量と純度の比較

MASS解析 データ提供元:金沢大学 医学系 華山教授、大阪大学 iFReC 中井先生

MagCapture™ は、FBS 添加培地からも高純度なエクソソームが回収できるため低いバックグラウンドで MASS 解析が可能

健常ヒト血清由来エクソソームからのmiRNAおよびmRNAの回収量比較

実験データ

①各手法にて調製したエクソソームからのmicroRNAおよびmRNAの回収量比較
超遠心分離法とPSアフィニティー法によって健常ヒト血清サンプルからエクソソームを単離した後、microRNA Extractor® SP Kit (コードNo. 295-71701 )を用いてRNAを回収し、定量PCR法によりmicroRNA量(let-7a, muR-16, miR-92a, miR-142-3p)およびmRNA量(GAPDH, PIK3CB)をCt値で比較した。

実験データ

超遠心分離法よりPSアフィニティー法で回収したエクソソームから効率良くmicroRNAおよびmRNAを回収できた。



②PSアフィニティー画分からのRNA抽出法の比較
PSアフィニティー法によって健常ヒト血清サンプルからエクソソームを単離した後、microRNA Extractor SP® Kit (コードNo. 295-71701)、またはAGPC法によってRNAを回収し、定量PCR法によりmicroRNA量(let-7a, muR-16, miR-92a, miR-142-3p)およびmRNA量(GAPDH, PIK3CB)をCt値で比較した。

実験データ

AGPC法よりmicroRNA Extractor SP Kitを用いることでエクソソームから効率良くmicroRNAおよびmRNAを回収できた。



関連製品:microRNA Extractor® SP Kit

ヒトや動物の血清・血漿からmicroRNAを含むTotal RNAを抽出するキットです。従来の抽出法で必要だったフェノール、クロロホルムなどの劇物を使用せずmicroRNAを高い収率で抽出できます。

コードNo. 品 名 容 量 希望納入価格(円)
295-71701 refrigerator 危険物 microRNA Extraxtor® SP Kit 50回用 57,000

エクソソームのプロテオミクス解析

<実験内容および結果>

PS アフィニティー法、超遠心分離法、ポリマー沈殿法を用いて、エクソソーム除去 FBS を 10% 含む K562 細胞培養上清からエクソソームを精製した。精製したサンプルを 10% ポリアクリルアミド電気泳動で分離し、タンパク質バンド全体を切り出した。その後、ゲル内消化を行い、LC-MS にてタンパク質を同定した。また、各手法で精製したエクソソーム (n=3) における同定タンパク質の pair-wise 相関の比較も行った。


同定したタンパク質の含有量トップ 10 比較

白カラム:エクソソーム由来ヒトタンパク質
灰色カラム:ウシ血清由来ウシタンパク質
赤字:エクソソームマーカータンパク質
サンプル:K562 細胞培養上清(エクソソーム除去済み 10% FBS 添加培地)


PS アフィニティー法 超遠心分離法 ポリマー沈殿法
1 Heat shock cognate 71 kDa Protein DNA-dependent protein kinase catalytic subunit Complement C3
2 Annexin A6 Transferrin receptor protein 1 Alpha-2-macroglobulin
3 Transferrin receptor protein 1 Serum albumin Fibronectin
4 V-type proton ATPase catalytic subunit A ATP-dependent RNA helicase A Serum albumin
5 Flotiillin-2 Tubulin beta-5 chain Thrombospondin-1
6 Programmed cell death 6-interacting protein Heat shock cognate 71 kDa protein Complement C4
7 4F2 cell-surface antigen heavy chain Fatty acid synthase Alpha-1-antiproteinase
8 Annexin A1 4F2 cell-surface antigen heavy chain Apolipoprotein B-100
9 Kinase D-interacting substrate of 220 kDa U5 small nuclear ribonucleoprotein helicase Hemoglobin fetal subunit beta
10 Annexin A2 Tubulin beta-4B chain Tubulin beta-5 chain

ポリマー沈殿法ではウシ血清由来タンパク質が多く混入しているのに対し、PS アフィニティー法ではエクソソームマーカータンパク質を多く同定できた


Pair-wise 相関を比較

サンプル:K562 細胞培養上清(エクソソーム除去済み 10%FBS 添加培地)


再現性
超遠心分離法
ポリマー沈殿法
ポリマー沈殿法

参考文献:Sci Rep. 2016 Sep 23;6:33935. Nakai W et al.


同じ手法間の相関性を確認したところ、ポリマー沈殿法と PS アフィニティー法は相関性が高く超遠心分離法は少し相関性が低いことが分かった。
各手法間の相関性は低い結果となった。→各手法が精製してくるエクソソームの集団が異なる?

Protein Assay BCA Kit を用いたエクソソームのタンパク質濃度定量

Protein Assay BCA Kit は、溶液中のタンパク質濃度をビシンコニン酸(BCA)を用いて定量できるキットであり、タンパク質定量法の中でも最も汎用されている。原理は、塩基性条件下でタンパク質が Cu2+ を Cu+ に還元することに基づいている。Cu+ が BCA と錯体を形成すると紫色のキレートが生じて、タンパク質濃度に依存して紫色が濃くなるため、この紫色を 562 nm の吸光度で測定し、標準曲線と比較することで溶液中のタンパク質濃度を定量できる。

今回は、MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS を用いて細胞培養上清から精製したエクソソームのタンパク質濃度を、Protein Assay BCA Kit の高感度プロトコールにより測定した。


【実験内容および結果】

96 ウェルプレート上に MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS から精製したエクソソーム溶液 25μL を分注し、Protein Assay BCA Kit に含まれる試薬 A と試薬 B の混合液を 200µL 添加した。その後、60℃で 30 分間インキュベーションして、560 nm の吸光度を測定した(図 1)。この結果から、Protein Assay BCA Kit の高感度プロトコールを使用することで、精製エクソソームのタンパク質濃度を測定できることが示された。


<BCA Assay プロトコール概要>
エクソソームのタンパク質濃度はかなり薄いため、BCA の場合はサンプルを希釈せずに測定を実施してください。

@スタンダード BSA 溶液 250、125、62.5、31.25、15.625µg / mL およびスタンダード BLANK を 25μL ずつ 96 ウェルプレートに添加する。
Aエクソソーム精製品および Elution Buffer(BLANK) を 25µL ずつ 96 ウェルプレートに添加する。
B Protein Assay BCA Kit(コード:297-73101)の試薬 A と試薬 B の混合液(A:B=50:1)をサンプルの入ったウェルに 200µL 添加する。
C 60℃で 30 分間インキュベートする。
D室温でプレートを冷ます。
E吸光度 560nm を測定する。


コードNo. 品名 容量 希望納入価格(円)
297-73101 Protein Assay BCA Kit 250 回用 15,000
015-25613 2 mg/mL Albumin Solution from Bovine Serum 1 mL × 10 9,000

エクソソームの標識と HeLa 細胞への取り込み実験

【実験概要】

MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS で精製した細胞外小胞を PKH67 (Sigma 社)で標識し、HeLa 細胞への取り込み能を確認した。

<Exosome PKH67 標識>

  1. MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS でエクソソームを精製する。(実験当日に K562 細胞培養上清からエクソソームを精製。)
  2. BCA Assay および NanoSight を用いてサンプルのタンパク質濃度と粒子濃度を測定する。
  3. 1.5 mL チューブにタンパク量で 5µg 相当のエクソソームサンプル溶液を分注する。
    *適宜必要量を調製してください。
  4. 2.0µL の PKH67 linker を 0.25 mL の DiluentC(PKH67 キット添付)に溶解させる。…4 × Dye solution
    *適宜必要量を調製してください。
  5. サンプルに対して 1/3 量の 4 × Dye solution を添加し、混合後に室温で 5-10 分間インキュベーションする。
  6. Exosome Spin Columns (MW 3000)(Thermo 社 #4484449) を添付プロトコルに沿って PBS で平衡化する。
  7. 上記平衡化済みカラムに 100µL ずつ各サンプルをアプライし、遠心する(最大添加量:100µL)。
    *必要本数準備してください。
  8. 前日ディッシュに播種しておいた HeLa 細胞に溶液を添加し、24 時間後に顕微鏡観察およびフローサイトメーター解析を実施する。
    *添加するエクソソーム量を調節してください。

顕微鏡観察結果
フローサイトメーター解析結果

K562 培養上清 16 mL から限外ろ過濃縮した培養上清 4 mL をサンプルとし、PS アフィニティー法にてエクソソーム精製を行った。
・精製エクソソームのタンパク質濃度:22.3 ng/&mico;L
・粒子濃度:1.2 × 108 particles/mL
上記方法で標識したエクソソーム溶液全量を前日播種した HeLa 細胞へ添加し、24 時間後の取り込みを蛍光顕微鏡(左)およびフローサイトメーター(右)で検出した。

Opti-MEM:ネガティブコントロールとして同量を PKH 標識後、細胞へ添加した。


PKH67 標識されたエクソソームがエンドサイトーシスで取り込まれていることが、顕微鏡でもフローサイトメーターでも確認できた

細胞培養上清・血清・血漿 前処理プロトコール

本工程はサンプルの前処理ステップです。エクソソームとその他の細胞外小胞(マイクロベジクルなど)を取得したい場合は下記プロトコールに従い 1,200 × g 遠心分離上清画分※ 1 を調製してください。またエクソソームをより高純度に取得したい場合は下記プロトコールに従い 10,000 × g 遠心分離上清画分※ 2 を調製してください。

下記では、細胞培養上清および血清・血漿サンプルを用いる場合の前処理フローを記載しております。その他の体液サンプルを用いる場合は血清・血漿サンプルのプロトコールを参考に、適宜前処理プロトコールをご検討ください。


細胞培養上清・血清 前処理プロトコール

バッファー交換(限外濾過)プロトコール

50mL の TBS バッファーを用いて 1mL の遠心処理済み EDTA 血漿サンプルのバッファー交換を行います。

  1. 19mL の TBS を Vivaspin20 (100K)に添加する。
  2. 1mL の遠心処理済み EDTA 血漿上清画分を 1 の Vivaspin20 (100K)に添加し混合する。
  3. 2 の Vivaspin20 (100K)を 4℃で遠心処理します。
    (遠心条件は、メーカー取扱説明書をご参照ください。)
  4. 上部の液が減ってきたら 10mL の TBS を Vivaspin20 (100K)に追加する。
  5. 4℃で遠心分離処理する。
  6. 上部の液が減ってきたら 10mL の TBS を Vivaspin20 (100K)に追加する。
  7. 4℃で遠心分離処理する。
  8. 上部の液が減ってきたら 11mL の TBS を Vivaspin20 (100K)に追加する。
  9. サンプル液量が 1mL 以下になるまで 4℃で遠心処理する。
  10. 精製ステップへ進む。

※1 Exosome+Large Evsを取得したい場合、1,200×g上清を精製用サンプルとして使用してください。
※2 エクソソームを取得したい場合、10,000×g上清を精製用サンプルとして使用してください。
※3 Large EVsを取得したい場合、10,000×gで遠心分離して得られる「沈殿」をTBSに懸濁してサンプルとして使用してください。

※4 濃縮ステップは大容量(〜50mL)の細胞培養上清から精製する場合のオプションですが、回収効率が向上するため、可能な限り実施して下さい。

MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS 操作フロー

操作フロー

参考文献

W. Nakai, T. Yoshida, D. Diez, Y. Miyatake, T. Nishibu, N. Imawaka, K. Naruse, Y. Sadamura & R. Hanayama, Sci Rep 6, 33935 (2016).
S. Osawa, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 488(1), 232-238 (2017).
S. Nagashima, et al., J. Virol., 91(22), Published Online (2017).
T. Yoshida, et al., Curr. Protoc. Cell Biol., Published Online (2017).
S. Saito, et al., Sci Rep 8, 3997 (2018).

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コードNo. 品 名 容 量 希望納入価格(円)
080-10231 freeze ヒトTIM1/ヒトFcキメラ, 組換え体 100µg 70,000
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130-18501 freeze マウスTIM3/ヒトFcキメラ, 組換え体 100µg 75,000
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098-07141 freeze IgG1 Fc, ヒト, 組換え体 100µg 58,000
095-07151 freeze IgG1 Fc(non-lytic), ヒト, 組換え体 100µg 58,000
092-07161 freeze IgG2a Fc, マウス, 組換え体 100µg 58,000
099-07171 freeze IgG2a Fc(non-lytic), マウス, 組換え体 100µg 58,000

MagCaptureシリーズ用 磁気ビーズ捕集用マグネットスタンド

マグネットスタンド

本品は、磁気ビーズ捕集用のマグネットスタンドです。MagCaptureシリーズに代表される細胞培養上清、血清、尿等の検体に含まれる特定成分の精製を行う磁気ビーズ法にてご使用いただけます。 1.5ml(2.0ml)のマイクロチューブ16本を一括で操作が可能で、また強力な磁石を配置したことで、微小の磁気ビーズの捕集も短時間に行えるため、待ち時間のストレスを感じさせません。

コードNo. 品 名 容 量 価格(円)
290-35591 マグネットスタンド 1個 60,000

refrigerator・・・2〜10℃保存   freeze・・・-20℃保存   -80 degree C・・・-80℃保存   表示がない場合は室温保存です。
特定毒物・・・特定毒物   毒物1 毒物2・・・毒物   劇物1 劇物2 劇物3・・・劇物   毒薬・・・毒薬   劇薬・・・劇薬   危険物・・・危険物   向精神薬・・・向精神薬
特定麻薬向精神薬原料・・・特定麻薬向精神薬原料   化審法 第一種特定化学物質・・・化審法 第一種特定化学物質   化審法 第二種特定化学物質・・・化審法 第二種特定化学物質
化学兵器禁止法 第一種指定物質・・・化学兵器禁止法 第一種指定物質   化学兵器禁止法 第二種指定物質・・・化学兵器禁止法 第二種指定物質
カルタヘナ・・・カルタヘナ   覚せい剤取締法・・・覚せい剤取締法   国民保護法・・・国民保護法

*上記以外の法律および最新情報は、siyaku.com(http://www.siyaku.com/)をご参照下さい。

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表示している希望納入価格は「本体価格のみ」で消費税等は含まれておりません。
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富士フイルム和光純薬工業

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