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PA tagシリーズに磁気ビーズが追加!
MagCapture™ HP Anti PA tag Antibody Magnetic Beads

イメージ PA tag Systemは、ペプチドタグ(12アミノ酸残基)に対するラットモノクローナル抗体(NZ-1)を使用した日本発のアフィニティー精製タグシステムです1)。NZ-1はPA tagに対する高い親和性と特異性を持ち、免疫沈降を用いてPA tag融合タンパク質を高純度かつワンステップで精製可能です2)。また、ウェスタンブロッティングやフローサイトメトリー、免疫細胞染色(ICC)に応用でき、PAタグ洗浄溶液を用いて使用済みの各ビーズを簡単に再生することも可能です1), 3)

最近、PA tagとNZ-1複合体の結晶構造が解かれ、PA tagがβターン構造をとることが明らかになりました4)。この特長を応用した「膜タンパク質ループ構造へのPA tag挿入アプリケーション」も報告されています4), 5)。

今回、新たに抗PAタグ抗体を固定化した磁気ビーズ「MagCapture™ HP 抗PAタグ抗体磁気ビーズ」をラインアップに追加しました。PA tag融合タンパク質の精製や免疫沈降にご使用下さい。


リンク関係


特長

  • 非特異的結合が少ない
  • PA tagペプチド、酸溶液、2M MgCl2 溶液による溶出を選択可能
  • 遠心操作不要
  • 再生利用可能

製品スペック

〔バッファー組成〕
 1×TBS (pH 7.4), 50% glycerol,
 0.05w/v% sodium azide
〔固定化抗体〕
 抗PAタグ, ラットモノクローナル抗体(NZ-1)
〔固定化抗体サブクラス〕
 IgG2a
〔抗原結合容量〕※1
 16 μg protein / 1 mL beads slurry
〔使用量〕※2
 1 mL培養上清 / 50〜100 μL beads slurry
 200〜1,000 μL細胞溶解液 / 50 μL beads slurry


※1 上記結合容量は目安です。タンパク質によって結合量は変化します。
※2 上記ビーズ使用量は目安です。目的のタンパク質、細胞種など実験系に応じて最適な使用量をあらかじめご検討ください。

組換え PA tag 融合 EGFP の添加回収実験

K562 細胞溶解液に添加した組換え PA tag 融合 EGFP タンパク質の回収性能を確認した。


M: 分子量マーカー
1: 1% Input (K562細胞溶解液+PA tag融合EGFP)
1’: 5% Input(K562細胞溶解液+PA tag融合EGFP)
2: 2 x SDS sample Buffer溶出
3: PA peptide競合溶出
4: 0.1M Glycine-HCl(pH3.0)溶出
5: 2M MgCl2溶出

検出抗体: 抗PAタグ抗体-HRP(コードNo. 015-25951)


どの溶出条件でも高純度の組換えPA tag融合EGFPが精製できた

抗 PA tag 抗体磁気ビーズの再生実験

使用済み抗 PA tag 抗体磁気ビーズの再生利用性能を確認した。2×SDS sample buffer を用いて溶出したサンプルを比較対象とし、再生した磁気ビーズを用いて回収能を確認した。再生には、PA tag Washing Solution (コードNo. 169-27261) を使用した。


M: 分子量マーカー
1: 1% Input(K562細胞溶解液+PA tag融合EGFP)
1’: 5% Input(K562細胞溶解液+PA tag融合EGFP)
2: 2 x SDS sample Buffer
3: PA peptide競合溶出(再生回数1回)
4: PA peptide競合溶出(再生回数2回)
5: PA peptide競合溶出(再生回数3回)

検出抗体: 抗PAタグ抗体-HRP(コードNo. 015-25951)


磁気ビーズを3回再生利用しても問題なく組換えPA tag融合EGFPを回収・精製できた⇒コストダウン

PA tag Peptide による競合溶出回数の検討実験

競合溶出の回数を複数回繰り返すことによって目的タンパク質回収量の増加が可能であるか検討を行った。
溶出条件としては、競合溶出反応のインキュベーション時間30分でPA tag融合GFPタンパク質の溶出を行う条件(レーン3)と、競合溶出反応を15分行う条件(レーン4)、レーン4の条件で溶出した後に回収した磁気ビーズに再度PA tag Peptide溶液を添加して溶出を2回(レーン5)、3回(レーン6)繰り返し行った条件を用いた。なお、各条件で得られた溶出サンプルはウェスタンブロットにて目的タンパク質の回収量の比較を行った。


M: 分子量マーカー
1: 2.5% Input(K562細胞溶解液+PA tag融合EGFP)
2: 2 x SDS sample Buffer溶出
3: PA peptide競合溶出(インキュベーション時間: 30 min×1回)
4: PA peptide競合溶出(インキュベーション時間: 15 min, 1回目)
5: PA peptide競合溶出(インキュベーション時間: 15 min, 2回目)
6: PA peptide競合溶出(インキュベーション時間: 15 min, 3回目)

検出抗体: 抗PAタグ抗体-HRP(コードNo. 015-25951)


PA tag Peptideで競合溶出を複数回繰り返すとPA tag融合EGFPの回収量を増やせることが確認できた

PA tag System を使用したアプリケーションデータ

●PA tag をフローサイトメトリーに応用した例

イメージ

抗 PA tag 抗体を用いて PA-ウサギポドプラニンを発現した CHO-K1 細胞をフローサイトメトリーにより検出しました。細胞に抗 PA tag 抗体(1 μg/mL)を 30 分間反応させ、その後 Oregon Green 標識抗ラット IgG 抗体を 30 分間反応させました。→PA tag は、生細胞条件下で抗体を反応させることも可能です。

データ提供: 東北大学大学院医学系研究科 加藤幸成先生、金子美華先生

●PA tagを免疫細胞化学染色に使用した例

イメージ

IDH2(Isocitrate Dehydrogenase 2)-PA tag を発現した CHO-K1 細胞を抗 PA tag 抗体により検出しました。細胞に抗 PA tag 抗体(1 μg/mL)を 30 分間反応させ、その後 Alexa488 標識抗ラット IgG 抗体を 30 分間反応させ、蛍光顕微鏡で検出しました。→PA tagは、高感度かつ特異的に目的タンパク質を検出可能です。また、PA tag配列内に塩基性アミノ酸のリジンやアルギニンを含まないため、ホルマリンやパラホルムアルデヒドの影響を受けにくいです。

データ提供: 東北大学大学院医学系研究科 加藤幸成先生、金子美華先生



参考文献

  1. Fujii, Y. et al., Protein Expr. Purif., 95, 240-7 (2014).
  2. 藤井勇樹ら, 蛋白質科学会アーカイブ, 7, e075 (2014).
  3. Kaneko, M. K. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 432, 40-45 (2013).
  4. Fujii, Y. et al., J. Cell Sci., 129, 1512-1522 (2016).
  5. 松永 幸子、有森 貴夫、高木 淳一: 和光純薬時報, 85(1), 2-4 (2017).

価格表

コードNo. 品 名 容 量 希望納入価格(円)
137-18751  MagCapture™ HP Anti PA tag Antibody Magnetic Beads 2mL 65,000

*本キットは体外診断用ではありません。
*希望納入価格には消費税等が含まれておりません。

掲載されている試薬は、試験・研究の目的のみに使用されるものであり、「医薬品」、「食品」、「家庭用品」などとしては使用できません。
表示している希望納入価格は「本体価格のみ」で消費税等は含まれておりません。
表示している希望納入価格は本記事掲載時点の価格です。最新価格は「製品検索」からコードNo.で検索してご確認ください。

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