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イメージ 培養上清中エクソソームの定性・定量解析の新規ツール!!
PS Capture™ Exosome ELISA Kit (Anti Mouse IgG POD)


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製品概要

細胞培養上清体液検体から精製した細胞外小胞の定性解析および細胞培養上清検体中の細胞外小胞の定量解析に利用できる酵素免疫測定試薬です。
細胞外小胞表面のホスファチジルセリン(PS)特異的に結合するタンパク質を固相化したプレートに細胞外小胞を反応させて固定化した後、任意の細胞外小胞表面マーカータンパク質に対するマウスモノクローナル抗体を検出一次抗体に、キットのHRP標識抗マウスIgG抗体を検出二次抗体に用いることで、任意のマーカータンパク質を表面に有する細胞外小胞を高感度に検出できます。

<参考文献>
“A novel affinity-based method for the isolation of highly purified extracellular vesicles”, W. Nakai, T. Yoshida, D. Diez, Y. Miyatake, T. Nishibu, N. Imawaka, K. Naruse, Y. Sadamura & R. Hanayama, Sci Rep 6, 33935 (2016).

製品特長

PS結合分子Tim4
固相化プレート採用
ホスファチジルセリン(PS)結合分子による捕捉※1
0.1μL相当の培養上清中細胞外小胞が検出可能
精製細胞外小胞標準品※2を用いた定量的測定
WB法※3より50〜1,000倍程度高感度な検出
培養上清中細胞外小胞の高感度定性・定量
  ※1 抗体固相化プレートを用いたELISA系よりも高感度に細胞外小胞を定性・定量できることを確認しています。
※2 MagCapture™ Exosome Isolation Kit PSを用いて精製した細胞外小胞標準品をご使用ください。
※3 WB法:ウェスタンブロット法
最適化された
試薬キット化
最適化されたコントロール用1次抗体※4
最適化された検出用2次抗体※5
発色法採用
簡単操作
高い実験再現性
  ※4 抗ヒトCD63抗体が付属しています。その他の表面マーカータンパク質を検出したい場合は任意のマウスモノクローナル抗体をご利用ください。
※5 抗マウスIgG抗体-HRP標識が付属しています。

測定原理/キット内容

測定原理

測定原理

キット内容
キット構成(96回用) 容  量
Exosome Capture 96 Well Plate 1枚 (8well×12strips)
Reaction / Washing Buffer (10×) 50mL×2本
Exosome Binding Enhancer (100×) 10mL×1本
Control Primary Antibody Anti-CD63 (100×) 120μL×1本
Secondary Antibody HRP-conjugated Anti-mouse IgG (100×) 120μL×1本
TMB Solution 12mL×1本
Stop Solution 12mL×1本
Plate Seal 4枚
取扱説明書 1部


コードNo. 品 名 容 量 希望納入価格(円)
297-79201 refrigerator PS Capture™ Exosome ELISA Kit (Anti Mouse IgG POD) 96回用 58,000

※体液検体については、MagCapture™ Exosome Isolation Kit PSを用いて精製した細胞外小胞を用いて定性解析を行うことが可能です。

用途

(1)細胞培養上清および体液検体から精製した細胞外小胞の定性解析

任意の細胞外小胞表面マーカータンパク質に対するマウスモノクローナル抗体を検出一次抗体に用いることで、細胞培養上清や体液検体から MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS を用いて精製した細胞外小胞の表面マーカータンパク質の定性解析を高感度に行うことができます。

(2)細胞培養上清検体中の細胞外小胞の定量解析

細胞培養上清から MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS を用いて精製した細胞外小胞を標準品に用い、任意の細胞外小胞表面マーカータンパク質に対するマウスモノクローナル抗体を検出一次抗体に用いることで、細胞培養上清検体中の任意のマーカータンパク質陽性細胞外小胞を定量することができます。


※ キットのコントロール検出一次抗体である Control Primary Antibody Anti CD63 はヒト CD63 を検出できますが、マウス、ラット、ウシ CD63 は検出できません。ヒト CD63 以外の表面マーカータンパク質を検出したい場合は適切なマウスモノクローナル抗体をご使用ください。

※ キットの検出二次抗体である Secondary Antibody HRP-conjugated Anti mouse IgG は検体中のマウス IgG に強く非特異反応し、ヒト IgG、ラット IgG に弱く非特異反応するため、これらの IgG を含む血清や血漿などの検体の定量解析はお控えください。

各種細胞培養上清から精製した細胞外小胞の定性解析

各種細胞培養上清から精製した細胞外小胞 1ngをウェルに添加し、表面マーカーCD9、CD63、CD81を認識する検出一次抗体を用いて各表面マーカー量を本キットで定性比較した。
また、比較参考データとして各種細胞培養上清から精製した細胞外小胞 150 ngを電気泳動し、表面マーカーCD9、CD63、CD81を認識する検出一次抗体を用いて各表面マーカータンパク質量をウェスタンブロットで定性解析した。


ELISA 系と WB 解析間でマーカータンパク質の発現パターンの相関性が確認できた

参考データ:各種細胞のエクソソームマーカータンパク質発現解析


■検出抗体
 <ELISA>
 抗 CD9 マウスモノクローナル抗体(M-L13)
  BD Bioscience 社

 抗 CD63 マウスモノクローナル抗体(H5C6)
  BD Bioscience 社

 <WB>
 抗 CD9 ウサギポリクローナル抗体
  System Bioscience 社

 抗 CD63 マウスモノクローナル抗体(8A12)
  コスモバイオ社

 抗 CD81 マウスモノクローナル抗体(1D6)
  Novus, Code No. 559-30131


各種細胞の培養上清由来精製エクソソーム(MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS 使用)を 1ng ずつ用い、エクソソームマーカータンパク質 CD9、CD63、CD81 に対する抗体を用いて、発現プロファイリングを行った。

細胞株によって発現量が異なる。
ある種の細胞株では特定のマーカータンパク質の発現量が少ないエクソソームの存在が示唆された。

正常ヒト血清から精製した細胞外小胞の定性解析

正常ヒト血清の個別6検体からそれぞれ細胞外小胞を精製し、BCAアッセイにて細胞外小胞膜上のタンパク質濃度を算出した。40ng、20ng、10ngの細胞外小胞をウエルに添加し、表面マーカーCD63を認識するコントロール検出一次抗体を用いて測定したOD値を定性比較した。

体液検体から精製した細胞外小胞を使うとしっかりと直線性が確認できた

細胞培養上清から精製した細胞外小胞の検出感度参考データ

COLO201細胞培養上清から細胞外小胞を精製し、本キットとウェスタンブロットの検出感度を比較した。

ウェスタンブロットとELISAの検出感度比較
(a), (b) 各種抗CD63抗体(他社品, 和光品: Code No. 012-27063)を用いたウェスタンブロット検出感度データ
サンプル: COLO201細胞培養上清から精製した細胞外小胞(MagCapture™ Exosome Isolation Kit PSで精製)
:各抗体におけるウェスタンブロットにおける検出限界

(C) Exosome ELISA Kit検出限界値データ
本キットを用いてCOLO201細胞由来の精製細胞外小胞 (MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS使用)を段階希釈したサンプル及びバッファーのみのブランク値を測定しCOLO201標準曲線を作成した。その標準曲線を用いてCOLO201由来精製サンプルの最低検出感度を算出した。(各濃度ポイントはn=6で、Blankポイントはn=12で測定した。)

ウェスタンブロットよりも高感度にマーカータンパク質を検出できた

細胞培養上清検体の希釈直線性 (Linearity) 参考データ

COLO201細胞の培養上清から精製した細胞外小胞を標準に用いて標準曲線を作成し、COLO201細胞培養上清の5段階希釈検体(1:100〜1:1,600)の希釈直線性を評価した。

COLO201細胞培養上清
CM volume(μL) Dilution 実測値 理論値 % of expected
Ratio Factor (×) ng/mL ng/mL
0.0625 1:1600 0.000625 0.89 0.91 98.4
0.125 1:800 0.00125 1.82 1.72 105.6
0.25 1:400 0.0025 3.44 3.52 97.8
0.5 1:200 0.005 7.04 6.78 103.9
1 1:100 0.01 13.6 - -
スタンダード:COLO201細胞由来Exosome
       (MagCapture™ Exosome Isolation Kit PSを用いて精製)
測定サンプル:COLO201細胞培養上清
一次抗体:キット付属 抗CD63抗体

良好な希釈直線性と培養上清 0.1µL 相当量中の細胞外小胞も検出できることが確認できた

細胞数および培養日数ごとの培地中細胞外小胞量の測定

1 × 107、2 × 107、3 × 107 の COLO201 細胞を T75 flask に播種し、72 時間培養した。24 時間毎に培養上清サンプルを一部回収し、PS Capture™ Exosome ELISA Kit (Anti Mouse IgG POD)およびキット付属のControl Primary Antibody Anti CD63(100 ×)を用いて、CD63 の吸光度測定を行った。

細胞培養上清は 4µL 用意し、Exosome Binding Enhancer 添加済みの反応/ 洗浄液(1 ×)を用いて 100µL に希釈した。


  • 測定サンプル:COLO201 細胞培養上清(25 倍希釈)
  • 播種細胞数:1 × 107、2 × 107、3 × 107 cells/T75 flask
  • 培養期間:24 時間、48 時間、72 時間
  • 一次抗体:抗 CD63 抗体

4µL の培地を用いるだけで培地中の細胞外小胞量を直接測定できるので、新規の細胞株の培養条件を検討する際、条件検討に手間がかからないのでお勧めです。

簡便に一番細胞外小胞が分泌される条件を検討できます。


薬剤添加による細胞外小胞産生量変化

K562 細胞を T225 flask に播種し、無血清培地で 72 時間培養した。その後、モネンシンナトリウムを終濃度 10µM になるように添加した無血清培地または無添加の無血清培地に交換し、24 時間培養した。培養後、培養上清サンプルを回収し、PS Capture™ Exosome ELISA Kit (Anti Mouse IgG POD) およびキット付属の Control Primary Antibody Anti CD63(100 ×)を用いて、CD63 の吸光度測定を行った。

10 倍希釈および 100 倍希釈の細胞培養上清サンプルは、回収した細胞培養上清を Exosome Binding Enhancer 添加済みの反応/ 洗浄液(1 ×)を用いて希釈して用意した。


  • 測定サンプル:K562 細胞培養上清
    (モネンシンナトリウム添加培地およびコントロール培地に交換後 24 時間培養)
  • 一次抗体:抗 CD63 抗体

精製不要のため、培養中の培地を少量抜き取って測定可能。
培地中エクソソーム量の経時的な変化も測定でき、エクソソーム変化量を数値化できるため WB よりも比較しやすい。

COLO201 細胞培養上清由来およびヒト血清由来精製エクソソームを用いた検出感度比較

下記の@〜Eのサンプルを調製し、PS Capture&tade; Exosome ELISA Kit、A 社 ELISA キット、A 社 ELISA キット(高感度タイプ)を用いて、エクソソームマーカータンパク質である CD63 を検出した場合の感度を比較した。

【使用サンプル内容】

@ A 社 ELISA キット付属スタンダード
A A 社 ELISA キット(高感度タイプ)付属スタンダード
B MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS 精製 COLO201 細胞培養上清由来エクソソーム
C ポリマー沈殿精製 COLO201 細胞培養上清由来エクソソーム
D MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS 精製ヒト血清由来エクソソーム
E ポリマー沈殿法精製ヒト血清由来エクソソーム

【希釈率およびタンパク質濃度】

@ A B C D E
× 1 1/16 1/1000 40 ng/mL 160 ng/mL 800 ng/mL 2000 µg/mL
× 0.5 1/32 1/2000 20 ng/mL 80 ng/mL 400 ng/mL 1000 µg/mL
× 0.25 1/64 1/4000 10 ng/mL 40 ng/mL 200 ng/mL 500 µg/mL
× 0.125 1/128 1/8000 5 ng/mL 20 ng/mL 100 ng/mL 250 µg/mL
× 0.0625 1/256 1/16000 2.5 ng/mL 10 ng/mL 50 ng/mL 125 µg/mL

【結 果】

PS Capture™ Exosome ELISA Kit は、A 社 ELISA キットおよび A 社 ELISA キット(高感度タイプ)よりも高感度に CD63 を検出できた。また、A 社 ELISA キットおよび A 社 ELISA キット(高感度タイプ)は、各キット添付スタンダードへ強く反応したが、PS 精製エクソソームへの反応性が低かった。

このことから、PS Capture™ Exosome ELISA Kit はエクソソーム表面上の CD63 を A 社および A 社(高感度タイプ)よりも特異的かつ高感度に検出できることが示唆された。

Q&A

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コードNo. 品 名 容 量 希望納入価格(円)
299-77603 refrigerator MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS 2回用*1 20,000
293-77601 10回用*1 80,000

*1 使用した磁気ビーズを4回まで再生利用可能です。バッファー類も十分量同梱されています。同一サンプルからの繰り返し抽出やコンタミネーションしないケースの場合、最大50回使用可能な製品となっています。ご検討下さい。

refrigerator・・・2〜10℃保存   freeze・・・-20℃保存   -80 degree C・・・-80℃保存   表示がない場合は室温保存です。
特定毒物・・・特定毒物   毒物1 毒物2・・・毒物   劇物1 劇物2 劇物3・・・劇物   毒薬・・・毒薬   劇薬・・・劇薬   危険物・・・危険物   向精神薬・・・向精神薬
特定麻薬向精神薬原料・・・特定麻薬向精神薬原料   化審法 第一種特定化学物質・・・化審法 第一種特定化学物質   化審法 第二種特定化学物質・・・化審法 第二種特定化学物質
化学兵器禁止法 第一種指定物質・・・化学兵器禁止法 第一種指定物質   化学兵器禁止法 第二種指定物質・・・化学兵器禁止法 第二種指定物質
カルタヘナ・・・カルタヘナ   覚せい剤取締法・・・覚せい剤取締法   国民保護法・・・国民保護法

*上記以外の法律および最新情報は、siyaku.com(http://www.siyaku.com/)をご参照下さい。

掲載されている試薬は、試験・研究の目的のみに使用されるものであり、「医薬品」、「食品」、「家庭用品」などとしては使用できません。
表示している希望納入価格は「本体価格のみ」で消費税等は含まれておりません。
表示している希望納入価格は本記事掲載時点の価格です。最新価格は「製品検索」からコードNo.で検索してご確認ください。

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