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免疫沈降、免疫染色、ウェスタンブロットに使用可能
Anti Human AGO2, Monoclonal Antibody (Clone No. : 4G8)

Argonaute2(AGO2)は、 RNAi 経路において、標的mRNAへのガイド分子となる siRNAやmicroRNAに結合し、標的mRNAの認識、切断を行なうRISC (RNA-induced silencing complex)の主要コンポーネントとして同定されたタンパク質です。
本品は、ウェスタンブロットや免疫染色だけでなく、免疫沈降に使用できる高品質な抗体です。免疫沈降により回収したAGO2タンパク質は、RNAi 経路に存在するRNA(microRNA, siRNAなど)と結合しています。


特長

  • 免疫沈降、免疫染色、ウェスタンブロットに使用可能
  • ヒトAGO2に対する高い特異性
  • ヒト以外には交差しない
  • 免疫沈降によりRISCに取込まれたmicroRNAを精製可能

症状

  • 濃度:ラベルに記載
  • 組成:0.09% Sodium Azide, 10% Glycerol TBS溶液, pH7.4
  • クローンNo.:4G8
  • サブクラス:IgG1
  • 抗原:組換えヒトAGO2タンパク質
  • 保存条件:2〜10℃(遮光), 凍結融解の繰返しは避けてください。

<希釈倍率>

用途
希釈倍率
Western Blot
1:100〜1:200
Immunoprecipitation
1:50
Immunohistochemistry
1:20〜1:50

使用例

1)HeLa細胞からのヒトAGO2 の免疫沈降

img
(データ提供: 慶応義塾大学 医学部分子生物学教室 塩見 春彦 先生、塩見 美喜子 先生)


図1.
〈HeLa 細胞からのヒトAGO2 の回収(免疫沈降)〉

  • HeLa 細胞を培養し、5-10 × 107cells を集め、PBS で2回洗浄する
  • 細胞を結合バッファー(*1) 500 μL で懸濁する
  • 氷上で5 分間インキュベートする
  • 超音波ホモジナイザーを用い、30% 出力で短く(5 秒× 3 回)超音波処理する
  • 20,000g で25 分間遠心分離する
  • 上清をGamma-Bind ビーズで固定化した抗ヒトAGO2 モノクローナル抗体(4G8)でインキュベートする。免疫沈降を始める直前に、ライセートに1 M NaCl(終濃度)を加える。反応液を4℃で少なくとも60 分間振とうする
  • そのビーズを1 M NaCl バッファーを含む結合バッファーで4 回洗浄する。ビーズを1 ×クリベージバッファー(* 2) で2 回洗浄する

*1 30 mM HEPES-KOH、pH 7.4、150 mM KOAc、2 mM MgOAc 、5mM DTT 、2μg/mL Pepstatin 、 2μg/mL Leupeptin、0.5% Aprotinin
*2 5×クリベージバッファー:125 mM HEPES-KOH、pH 7.4、250 mM KOAc、25 mM MgOAc、25 mM DTT


2)HeLa細胞からのヒトAGO2 の免疫沈降後画分のウェスタンブロット解析


img
(データ提供: 慶応義塾大学 医学部分子生物学教室 塩見 春彦 先生、塩見 美喜子 先生)


図2.
〈HeLa lysate のウエスタンブロット〉
約100kDa のAGO2 を検出できる
(抗体は100 倍希釈を使用)


3)HeLa細胞におけるヒトAGO2の局在解析

img
(データ提供: 慶応義塾大学 医学部分子生物学教室 塩見 春彦 先生、塩見 美喜子 先生)


図3. HeLa細胞の免疫染色像。本品の希釈倍率は1:50。内在性ヒトAGO2 タンパク質のP-bodyへの局在が観察できる。細胞質も弱いながら均一に染色されている。


4)4G8の特異性(免疫沈降)

img

図4. 本品(4G8)を用いて、ヒト培養細胞株4種類(HeLa、HepG2、HEK293、THP-1)、およびマウス培養細胞株(P388D1)から免疫沈降法により取得したタンパク質を、SDS-PAGEおよびWestern Blotにより検出した。ヒト培養細胞から特異的に内在性Ago2タンパク質が回収でき、マウスAgo2には反応せずヒトAgo2特異的であることを確認した。各細胞株の細胞数は5×106相当。

5)ヒト培養細胞株(HeLa、HepG2、HEK293、THP-1)からのmicroRNA精製

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図5.  ヒト培養細胞株4種類(HeLa、HepG2、HEK293、THP-1)、およびマウス培養細胞株(P388D1)から、本キットにより精製したmicroRNA画分のUrea-PAGEによる検出。ヒト培養細胞特異的にmicroRNAが精製できた。各細胞株の細胞数は5×106相当。


6)in vitro target RNA cleavage assay

img
(データ提供: 慶応義塾大学 医学部分子生物学教室 塩見 春彦 先生、塩見 美喜子 先生)


図6.  

in vitro target RNA cleavage assay〉
1. 氷上で反応液(* 3)30 μL を調製する
2. 反応液を37℃で90 分間インキュベートする
3. ISOGEN-LS を用いてRNA を精製する
4. 6% アクリルアミド未変性ゲルで分離する
5. BAS-2500 でシグナルを検出する


*3 反応液: ビーズ上の免疫精製ヒトAGO2、5×クリベージバッファー(*2)6 μL、40 U/μL RNase Inhibitor 1 μL、0.5 mg/mL Yeast
RNA 1 μL、3000-5000 cpm/μL miR-21 target RNA 1 μL、水21 μL


■4G8に関する文献

1) Miyoshi, K. et al. : Methods Mol. Biol., 442, 29(2008)
2) 和光純薬時報, 74(4), 2-4(2006).


製品情報

*Anti Human AGO2, Monoclonal AntibodyのコードNo.を変更いたしました。
旧コードNo. 016-20861(50μL) → 新コードNo. 011-22033(50μL)。

コードNo. 品 名 容 量 希望納入価格(円)
011-22033 Anti Human AGO2, Monoclonal Antibody   (NEW !!)
50μL
30,000
015-22031
100μL
50,000
014-22023 Anti Mouse AGO2, Monoclonal Antibody  (NEW !!)
50μL
30,000
018-22021
100μL
50,000
292-66701 microRNA Isolation kit, Human Ago2
10回用
45,000
290-66501 microRNA Cloning kit Wako
8回用
63,000
298-65103 Single Strand DNA Ligase, thermostable, recombinant, Solution
200units
43,000
292-65101
500units
87,000

*表示している希望納入価格は「本体価格のみ」で消費税等は含まれておりません。
*表示している希望納入価格は2012年12月の価格です。最新価格は「製品検索」からコードNo.で検索してご確認ください。

■ 参考文献

1) Fire, A. et al. : Nature, 391 , 806 - 811(1998).
2) Gil, J. and Esteban, M. : Apoptosis, 5 , 107 - 114(2000).
3) Elbashir, S. M. et al. : Nature, 411 , 494 - 498(2001).
4) Dykxhoorn, D. M. and Lieberman, J. : Cell, 126 , 231 - 235(2006).
5) Gregory, R. I. et al. : Cell, 123, 631- 640(2005).
6) Rand, T. A. et al. : Cell, 123, 621 - 629(2005).
7) Tomari, H. and Zamore, P. D. : Genes Dev., 19 , 517 - 529(2005).
8) Hammond, S. M. : FEBS Letter, 579 , 5822 -5829(2005).
9) Ambros, V. : Nature, 431 , 350 - 355(2004).
10) Liu, J. et al. : Nature Cell Biol., 7, 1261- 1266(2005)
11) Liu, J. et al. : Science, 305 , 1437 - 1441(2004).
12) Carmell, M. A. et al. : Genes Dev., 16 , 2733 -2742(2002).
13) Yuan, Y-R. et al. : Mol. Cell, 19, 405- 419(2005).
14) Song, J-J. et al. : Science, 305, 1026- 1032(2004).
15) Miyoshi, K. et al. : Genes Dev., 19 , 2837 -2848(2005).
16) Saito, K. et al. : Genes Dev., Epub Aug 1(2006).

 

掲載されている試薬は、試験・研究の目的のみに使用されるものであり、「医薬品」、「食品」、「家庭用品」などとしては使用できません。
表示している希望納入価格は「本体価格のみ」で消費税等は含まれておりません。
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