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標的mRNAスクリーニングに使用できます。
Target mRNA Cloning Kit Wako

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Target mRNA Cloning Kit Wako は微量mRNA をcDNA 増幅するキットです。
本品は、Ago タンパク質の免疫沈降RNA 画分に存在するmicroRNA と相互作用するmRNA をcDNA 化することが可能なキットです。それらのmRNA から合成されたcDNA をクローニングして得られたDNA 配列をもとに、microRNA の標的mRNA候補をスクリーニングできます。
本キットをAgo 免疫沈降法と併用することで、従来のデータベースを用いた標的mRNA の予測法ではなく、分子生物学的手法によりmicroRNA の標的mRNA のスクリーニングが可能になりました。

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特長

  • シンプルなプロトコール
  • 微量mRNA 増幅に最適
  • mRNA 鎖長に影響されずに増幅可能
  • Ago 免疫沈降との併用で標的mRNA 探索が可能

キット内容(10回用)

Target mRNA Cloning Kit Wakoは、14本の構成部材からなります。

(1)dT(20)-RT Primer(20pmol/μL) 10μL×1本
  5'-GACCATATGACGAGATCCGAGCTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3' (45mer)
(2)10×RT Buffer 20μL×1本
(3)dNTP Mixture Solution (2.5mmol/l each) 20μL×1本
(4)RNase Inhibitor(20U/μL) 10μL×1本
(5)Reverse Transcriptase(200U/μL) 10μL×1本
(6)0.5 mol/L EDTA Solution 20μL×1本
(7)1mol/L Tris-HCl Solution 200μL×1本
(8)Ethachinmate 30μL×1本
(9)10mol/L Ammonium Acetate Solution 480μL×1本
(10)2nd Strand Synthesis Primer(20pmol/μL) 10μL×1本
  5'-CATGGTATCGACGAGACTGAGGCTGNNNNNNNNNB -3'(35mer)
(11)5' PCR Primer(20pmol/μL) 10μL×1本
  5'-CATGGTATCGACGAGACTGAG-3'(21mer)
(12)3' PCR Primer(20pmol/μL) 10μL×1本
  5'-GACCATATGACGAGATCCGAG-3'(21mer)
(13)5' Colony PCR Primer(5pmol/μL) 960μL×1本
  5'-GTATCGACGAGACTGAGGCTG-3'(21mer)
(14)3' Colony PCR Primer(5pmol/μL) 960μL×1本
  5'-CGAGATCCGAGCTTCTTTTTT-3'(21mer)

<本キット以外に必要なもの>
(1) DNA増幅用酵素
耐熱性DNA合成酵素を使用する場合、ホットスタートPCR用の酵素をご使用下さい。
ニッポンジーン社のHOTGoldstarTM DNA Polymerase(コードNo. 314-80251, 310-80253)をお奨めします。
HOTGoldstarTM DNA Polymeraseは、PCRサイクルに入る前に95℃で10分間の熱処理によって酵素の活性化を行い、非特異的増幅を最小限に抑えることができます。
また、本酵素によって増幅された2本鎖DNA断片は、3'末端にAが突出しますので、T-ベクターに直接ライゲーション可能です。

(2) PCR Purification Kit Wako(コードNo. 298-67901)
PCR Purification Kit Wakoは、操作時間わずか10分間でRT-PCRやPCRによるDNA合成後に反応溶液中に含まれるプライマー、プライマーダイマー、dNTP、酵素を除去することができます。
PCR Purification Kit Wako取扱い説明書製品情報はこちら

その他必要試薬の詳細は下記のTarget mRNA Cloning Kit Wako取扱説明書をご参照ください。

pdf取扱い説明書(Instruction Manual)はこちら

原理

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使用例(miR-122 標的mRNA の探索)

< 実験の流れ >

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< @ 増幅されたcDNA の電気泳動結果 >


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< A標的mRNA のクローニング結果 >

本キットを使用してAgo2 IP RNA 画分からクローニングされたmiR-122 の標的配列を有するcDNA クローン

Context Score Percentile(CSP※1)
80以上
80未満
クローニング
された遺伝子
PIGS, BRPF1, SLC7A5, PPP1R9A, SLC1A5, ALDOA, OBFS2B etc…
TACC1, DKF7p761F198, NMF6, FLJ14397, MRP63, SH3GL1, DIS3 etc…


※1 CSP:Context Score Percentile
標的としての妥当性を示すパラメーター値(TargetScan)。
値が100 に近似するほど標的mRNA としての信頼性が高いことを示す値。


< B 定量PCR による標的mRNA の検証 >
mRNA 定量PCR の結果(CSP※1 ≧ 80 のクローンで検証)



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※ 2 Control 細胞
miR-122 導入HepG2 細胞のネガティブコントロールとして、ルシフェラーゼGL3 siRNA を導入したHepG2 細胞。


< 結果 >
Ago2 IP RNA画分を用いてTarget mRNA Cloning Kit WakoでcDNA増幅することにより、miR-122 の既知標的ALDOA に加え、新規の標的mRNA の候補が得られた。

参考文献

Hayashida, Y., et al . : A useful approach to total analysis of RISC-associated RNA., BMC Research Notes , 2, 169(2009)

価格

コードNo.
品 名
容 量
希望納入価格(円)
298-68001
Target mRNA Cloning Kit Wako (NEW !!)
10回用
60,000
291-70201
microRNA Isolation Kit, Human/Mouse Ago1 (NEW !!)
10回用
60,000
292-66701
microRNA Isolation Kit, Human Ago2
10回用

45,000

292-67301
microRNA Isolation Kit, Mouse Ago2
10回用
45,000
297-70301
microRNA Isolation Kit, Human Ago3 (NEW !!)
10回用
60,000
298-67901
PCR Purifi cation Kit Wako
30回用
15,000
310-80253
314-80251
HOTGoldstarTM DNA Polymerase*
50units
500units
5,600
45,000
015-22411
Anti Ago1, Monoclonal Antibody (2A7)
50μL
30,000
014-22023
018-22021
Anti Mouse Ago2, Monoclonal Antibody
50μL
100μL
30,000
50,000
011-22033
015-22031
Anti Human Ago2, Monoclonal Antibody
50μL
100μL
30,000
50,000
290-66501
microRNA Cloning Kit Wako
8 回用
63,000
298-65103
292-65101
Single Strand DNA Ligase, thermostable,
recombinant, Solution
200units
500units
43,000
87,000

Target mRNA Cloning Kit Wako と必ず併用して下さい。

 

掲載されている試薬は、試験・研究の目的のみに使用されるものであり、「医薬品」、「食品」、「家庭用品」などとしては使用できません。
表示している希望納入価格は「本体価格のみ」で消費税等は含まれておりません。
表示している希望納入価格は本記事掲載時点の価格です。最新価格は「製品検索」からコードNo.で検索してご確認ください。

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