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高効率 ・ 正確 ・ 簡便なアダプターライゲーションを実現
microRNA Cloning Kit Wako

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microRNA Cloning Kit wakoは、熱による不活性化が容易なエビ由来アルカリホスファターゼ(SAP)の脱りん酸反応と、一本鎖DNAおよび一本鎖RNAを高効率に連結可能な耐熱性リガーゼ(別売)によるアダプターライゲーション反応とを、同一の溶液中で反応させることが可能な和光純薬工独自の緩衝液を用います。これによって、簡便かつ高効率なアダプターライゲーションが可能になり、microRNAを容易にcDNA化することが可能になりました。


特長

  1) 耐熱性リガーゼによる高効率で正確なアダプターライゲーションが可能
  2) ヘアピン型microRNAのクローニングに最適
  3) RNA操作が少なく1.5 日でmicroRNAをコードするcDNAが作製可能


キット内容

(1) SAP   16μl 
(2) 5×SAP Buffer   64μl
(3) 40×Ligation Buffer   16μl
(4) RNase Inhibitor   16μl
(5) 10mmol/L MnCl2   16μl
(6) Reverse Transcriptase   8μl
(7) 10×RT Buffer   16μl
(8) dNTP Mixture   112μl
(9) 0.5 mol/L EDTA, pH 8.0   16μl 
(10) 1mol/L Tris-HCl, pH 7.5   160μl
(11) Ethachinmate   24μl
(12) 10mol/L Ammonium Acetate  960μl
(13) 3’ Adaptor(50pmol/μL)   8μl
(14) 5’ Adaptor(50pmol/μL)   8μl
(15) RT Primer(50pmol/μL)   8μl
(16) 5’ PCR Primer(50pmol/μL)   16μl
(17) 3’ PCR Primer(50pmol/μL)   16μl
(18) Control RNA(30ng/μL)   8μl

本キットには、耐熱性リガーゼ、およびPCR用の耐熱性DNAポリメラーゼは含まれておりません。

microRNA Cloning Kit Wakoには、別売の一本鎖DNAリガーゼ, 耐熱性, 組換え体, 溶液(コードNo. 292-65101, 298-65103)を必ずご使用ください。本酵素は1回のクローニングにつき、20 unitsを使用します。Buffer組成、および反応条件はすべてこの酵素に最適化しております。本酵素は、ATP依存性でDNAとRNAの両方のライゲーション反応に使用できます。また、最適反応温度が55〜65℃ですので、T4 RNA リガーゼと比較してmicroRNAとアダプターのライゲーション効率を大幅に改善できます。


操作概要図

・エビ由来アルカリホスファターゼ、耐熱性リガーゼ(別売)による反応が1チューブで可能です。
・3'アダプターをライゲーション後の、逆転写反応後すぐに0.2mol/L NaOHで加水分解するため、RNA操作が少なくてすみます。
・一連のアダプターライゲーション中に、変性ポリアクリルアミドゲルを一度も使用しないため、操作性がアップしました。

これらによって、クローニング可能なcDNAが1.5日で合成可能です。

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※ 本キットには、耐熱性リガーゼ、およびPCR用の耐熱性DNAポリメラーゼは含まれておりません。

従来のクローニング法との比較と改善点

 
従来のマイクロRNAクローニング法の欠点 
microRNA Cloning Kit Wakoによる改善
1. 
アダプターライゲーションの再現性が低い。  → 再現性が高い
2. 
アダプターライゲーションの際、非特異的ライゲーションが起こり、最終産物のバンドがスメアになる。   → リガーゼおよび反応Buffer条件の改善により非特異的ライゲーションを防止
3. 
脱リン酸反応後にBAPが残存するため、アダプターに対する非特異的な脱リン酸反応が起こる。   → SAPを使用しているので完全な熱変性が可能
4. 
磁気ビーズ用マグネットスタンドが必要。   → 不要
5. 
100ngのsmall RNAを使用しなければならないので、微量サンプルから抽出する際には困る。   → 50ngで使用可能
6. 
BAP処理、T4 RNA Ligase処理において、酵素反応後すべてでエタノール沈殿を行うので、small RNAをロスしてしまう。   → SAP、耐熱性ssDNA Ligaseを同一チューブ内で反応可能
7. 
アダプターのリン酸化反応工程があり煩雑。   → リン酸化工程はありません
8. 
RIを使用しないと検出できない。   → 不要
9. 
T4 RNA Ligaseは反応温度が16℃であるため、2次構造をとるmicroRNAのクローニング効率が低いのではと心配。   → 一本鎖DNAと一本鎖RNAを55℃〜65℃で反応可能な耐熱性リガーゼを使用するため、2次構造をとるmicroRNAのクローニング効率が上がる。


使用例 <HeLa 細胞に発現しているmicroRNAのクローニング実績>

98%以上のクローニング効率
70%以上のmicroRNA存在率

1) HeLa細胞(1×107 cells) より ISOGENにてTotal RNAを抽出。
2) Total RNA からSmallRNA画分をカラム抽出し、15% 変性アクリルアミドゲルにて200nt以下のSmallRNA画分を電気泳動後、20〜23nt付近を切り出し抽出。
3) microRNA Cloning Kit WakoでmicroRNAをコードするcDNAを合成し、T-ベクターにクローニング。
4) 大腸菌へT-ベクターを導入し、抗生物質を含むLB寒天培地にて形質転換体を96クローン選抜。
   (本実験では青白コロニー選抜は行っておりません)
5) コロニー PCR にて60〜63bp付近にcDNAの挿入を確認(図.1)。

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図.1 TAクローニングにより得られた大腸菌のコロニーPCR
得られた96クローンのうち、95クローンで挿入断片が確認でき、98%以上の高確率でクローニングが可能であった。

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図.2 本キットでクローニングしたsmall RNA
得られた96クローンよりプラスミドを抽出し、塩基配列を解析した後、データベース ( Sanger miRNA Registry )と照合したところ、96クローン中、70クローン(全体の73%)がmicroRNAであることを確認した(図.2)。これにより、非常に高効率にmicroRNAのクローニングが可能であることが示唆された。
70クローンの内訳は表.1をご参照ください。

表1. 上記グラフ記載の70クローンの内訳

microRNAの種類
クローン数
hsa-miR-23a
38
hsa-miR-92a
16
hsa-miR-22
5
hsa-miR-25
5
hsa-miR-23b
3
hsa-miR-19b
1
hsa-miR-21
1
hsa-miR-210
1
合計
70


価格

コードNo.
品名
容量
希望納入価格(円)
290-66501
microRNA Cloning Kit Wako
8回用
63,000
298-65103
一本鎖DNA リガーゼ, 耐熱性, 組換え体, 溶液
200 units
43,000
292-65101
500 units
87,000


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品名
容量
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040-28721
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8,000
312-01791
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0.2mL
15,000

*表示している希望納入価格は「本体価格のみ」で消費税等は含まれておりません。
*表示している希望納入価格は2012年12月の価格です。最新価格は「製品検索」からコードNo.で検索してご確認ください。

microRNA Cloning Kit Wakoは特許出願中です。(平成19年10月1日現在)

 

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