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microRNA ‘‘特異的’’ 精製キット
microRNA Isolation Kit, Human Ago2

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microRNA Isolation Kit, Human Ago2は、高品質の抗ヒトAgo2モノクローナル抗体を利用した免疫沈降法により、microRNA-Ago2複合体を回収し、microRNAを特異的に精製するキットです。
従来のmicroRNAの精製法(変性ポリアクリルアミドゲル抽出)では、rRNAやtRNAの分解産物が多く含まれてしまい、microRNAのクローニング効率を著しく低下させていました。
本キットは、Ago2に取り込まれたmicroRNAを高純度に含むRNA画分を調製でき、従来精製法に比べ簡便かつ特異的にmicroRNAの精製が可能です。


特長

1) 高効率にmicroRNAを精製可能
2) 特異性に優れた抗ヒトAgo2モノクローナル抗体を使用
3) 非特異的タンパク質の吸着が少ない高性能ビーズを使用
4) microRNAのクローニングに応用可能

原理

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キット操作概要


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キット内容 (10 回用) 

(1) Anti Human Ago2 Antibody Beads Solution   500μL×1 本
(2) Cell Lysis Solution    50mL×1 本
(3) Elution Solution    500μL×1 本
(4) Ethachinmate   30μL×1 本
(5) 3 mol/L Sodium Acetate    400μL×1 本

従来法との比較

  従来法 microRNA Isolation Kit, Human Ago2
Total RNA 抽出工程 不要
small RNA(≦200nt)の濃縮・精製 不要
変性アクリルアミドゲル作製 不要
変性アクリルアミドゲルからの切出し抽出 不要

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microRNA Isolation Kit, Human Ago2 使用例

1)ヒト細胞株のmicroRNA精製

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図1. microRNA Isolation Kit, Human Ago2を用いて、ヒト培養細胞株3 種類(HeLa、HepG2、HEK293)、およびマウス培養細胞株(P388D1)から精製したmicroRNA 画分をUrea-PAGE によって検出した。その結果、ヒト培養細胞から特異的にmicroRNA が精製できた。使用細胞数は5×106 相当。

 

2)精製microRNA画分のクローニング

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. rRNA……rRNA 分解断片のcDNA
. tRNA……tRNA 分解断片のcDNA

. Unknowns……ゲノム配列に一致しないcDNA
. Others ……… ゲノム配列に一致し、miRBase に未登録のcDNA

図2. microRNA Isolation Kit, Human Ago2 により、HeLa 細胞から精製したmicroRNA 画分をもちいてmicroRNA Cloning
Kit Wako でクローニングし、small RNA の分布を解析した。ランダムに選抜した95 クローンからプラスミドを抽出し、塩基配
列を解析した後,データベース(Sanger miRBase)と照合したところ、95 クローン中89 クローン(全体の93.7%)が
microRNA であることを確認した。89 クローンの内訳は表1を参照。

 

3)ヒト組織のmicroRNA精製
下記プロトコールにより、ヒト組織(Liver, Testis)からmicroRNA画分を精製した。

【ヒト組織抽出液の調整】

ヒト凍結組織約50mg(Liver, Testis)
↓←1mL Cell Lysis Solution
破砕(テフロンホモジナイザー使用)
↓←1mL Cell Lysis Solution
15分間 氷上で静置。
↓遠心分離(14,500rpmまたは20,000×g, 4℃, 20分)
上清を回収する。

0.45μmのフィルターでろ過する。

新しい2.0mLチューブに回収する。(細胞溶解液)

【抗体ビーズの使用前洗浄】

1) Anti Human Ago2 Antibody Beads Solution 50μLを1.5mLマイクロ遠心チューブに移す。
2) 4℃、5,600rpm(3,000 ×g)で30秒間遠心分離し、上清を除く。
3) ビーズペレットをCell Lysis Solution 1mLで懸濁し、4℃、5,600rpm(3,000 ×g)で30秒間遠心分離後、上清を除く。(洗浄済みビーズ溶液)

【microRNA画分の精製】

a) 抗原-抗体反応
1) 前洗浄済みAnti Human Ago2 Antibody Beads Solutionに、1mL 細胞溶解液(組織25mg由来) を添加しボルテックスミキサーで懸濁する。
2) 4℃でローテーターにより転倒混和し、3時間抗原抗体反応を行う。
3) 4℃、5,600rpm(3,000 ×g)で30秒間遠心分離し、上清を除く。

b) 反応後の洗浄
1) ビーズペレットにCell Lysis Solution 1mLを添加し、ボルテックスミキサーで懸濁する。
2) 4℃、5,600rpm(3,000 ×g)で30秒間遠心分離し、上清を除く。
3) 1)〜2)の操作をさらに2回繰り返す。洗浄操作は計3回行う。

c) 抗原溶出とmicroRNAの精製
1) ビーズペレットにElution Solution(注1)50μLを添加し、ボルテックスミキサーで懸濁する。
2) 4℃、5,600rpm(3,000 ×g)で30秒間遠心分離し、上清を1.5mLマイクロ遠心チューブに移す。(注2)
3) 滅菌水350μL、フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール (25:24:1) 400μLを添加し、ボルテックスミキサーで懸濁する。
4) 室温、14,500rpm(20,000 ×g)で10分間遠心分離する。
5) 上層(水層)を1.5mLマイクロ遠心チューブに移し(注3)、クロロホルム400μLを添加し、ボルテックスミキサーで混合する。
6) 室温、14,500rpm(20,000 ×g)で10分間遠心分離する。
7) 上層(水層)を1.5mLマイクロ遠心チューブに移し、Ethachinmate 3μL、3 mol/L Sodium Acetate 40μL、99.5% エタノール1mLを添加し、ボルテックスミキサーで混合する。
8) 4℃、14,500rpm(20,000 ×g)で15分間遠心分離し、上清を除く。
9) 沈殿に70% エタノール 溶液1mLを添加し、ボルテックスミキサーで混合する。
10) 4℃、14,500rpm(20,000 ×g)で10分間遠心分離し、上清を除く。
11) チューブの蓋を開けて室温で20分間放置し、ペレットを風乾する。
12) ペレットを滅菌水、またはTEバッファー10μLに溶解する。(注4)

注1.Elution Solutionは冷蔵保存により成分が析出していますので、使用前に室温に戻し、ボルテックスミキサーで攪拌後、成分が完全に溶解していることを確認してから使用してください。
注2.上清をマイクロピペッターで吸う際に、ビーズペレットを吸わないように注意してください。ビーズに非特異吸着した核酸が混入する場合があります。
注3.上層(水層)をマイクロピペッターで吸う際に、中間層を吸わないように注意してください。
注4. 溶解後のサンプルは-80℃で保存してください。

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Lane1: Single strand RNA (22nt), 1ng
Lane2: Liver lysate.
Lane3: Testic lysate.

図3. microRNA Isolation Kit, Human Ago2を用いて、ヒト組織(Liver, Testis)から精製したmicroRNA 画分をUrea-PAGE によって検出した。スタートの組織使用量は50mgで、最終の細胞溶解液2mLを得た。そのうち1mLを免疫沈降反応に使用し、最終のRNA画分量を10μLに調製した。そのうちの5μLをUrea-PAGE に供した。

4)精製microRNA画分のマイクロアレイ解析

【方法】

HeLa細胞 (1×10^5〜1×10^7 cells)から「microRNA Isolation Kit, Human Ago2」を使用してmicroRNA-Ago2複合体を回収した後、添付プロトコルに従ってmicroRNAを精製、「"3D-Gene®"Human miRNA Oligo chip (東レ株式会社)」にて解析した。

【解析データ】

<銀染色における電気泳動データの検出状況>

sample 1×10^5 cells 1×10^6 cells 1×10^7 cells
検出状況 ×


<検出スポットのスキャン画像>

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microRNA Isolation Kit, Human Ago2にて精製・回収されたmicroRNAを、高感度検出に優れている"3D-Gene®:"Human miRNA Oligo chipにて解析したところ、銀染色では検出が難しかった105個の細胞数でも300種類以上のmicroRNAが検出された。

細胞数に関しては106個以上の系において、Total RNAを使用する系で検出されにくい成熟microRNAが濃度依存的に検出された。

本結果から、濃縮キットと高感度DNAチップを組み合わせることでmicroRNAの研究における新たな機能解析が可能となることが示唆された。

価格表

コードNo. 品 名 容 量 希望納入価格(円)
292-66701 microRNA Isolation kit, Human Ago2
10回用
45,000
014-22023 Anti Mouse AGO2, Monoclonal Antibody(2D4)  (NEW !!)
50μL
30,000
018-22021
100μL
50,000
011-22033 Anti Human AGO2, Monoclonal Antibody(4G8)  (NEW !!)
50μL
30,000
015-22031
100μL
50,000
290-66501 microRNA Cloning kit Wako
8回用
63,000
298-65103 Single Strand DNA Ligase, thermostable, recombinant, Solution
200units
43,000
292-65101
500units
87,000

*Anti Human AGO2, Monoclonal AntibodyはコードNo.を変更いたしました。旧コードNo. 016-20861(50μL) → 新コードNo. 011-22033(50μL)。

*表示している希望納入価格は「本体価格のみ」で消費税等は含まれておりません。
*表示している希望納入価格は2012年12月の価格です。最新価格は「製品検索」からコードNo.で検索してご確認ください。

抗ヒトAgo2モノクローナル抗体の特異性

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注・・・この実験結果はmicroRNA Isolation Kit, Human Ago2を使用したものではありません。

図. 4 抗ヒトAgo2モノクローナル抗体を用いて、ヒト培養細胞株4種類(HeLa、HepG2、HEK293、THP-1)、およびマウス培養細胞株(P388D1)から免疫沈降法により取得したタンパク質を、SDS-PAGEおよびWestern Blotにより検出した。ヒト培養細胞から特異的にAgo2タンパク質が回収でき、マウスAgo2には反応せずヒトAgo2特異的であることを確認した。各細胞株の細胞数は5×106相当。

コードNo. 品名 容量 希望納入価格(円)
016-20861
Anti Human AGO2, Monoclonal Antibody
50μL
30,000

*表示している希望納入価格は「本体価格のみ」で消費税等は含まれておりません。
*表示している希望納入価格は2012年12月の価格です。最新価格は「製品検索」からコードNo.で検索してご確認ください。

参考文献

■ 抗ヒトAGO2, モノクローナル抗体(4G8)に関する参考文献

1)Miyoshi, K. et al. : Methods Mol Biol, 442, 29- 43(2008).
2) 和光純薬時報, 74(4), 2-4(2006) .

■ AGOファミリータンパク質に関する参考文献

1) Fire, A. et al. : Nature, 391 , 806 - 811(1998).
2) Gil, J. and Esteban, M. : Apoptosis, 5 , 107 - 114(2000).
3) Elbashir, S. M. et al. : Nature, 411 , 494 - 498(2001).
4) Dykxhoorn, D. M. and Lieberman, J. : Cell, 126 , 231 - 235(2006).
5) Gregory, R. I. et al. : Cell, 123, 631- 640(2005).
6) Rand, T. A. et al. : Cell, 123, 621 - 629(2005).
7) Tomari, H. and Zamore, P. D. : Genes Dev., 19 , 517 - 529(2005).
8) Hammond, S. M. : FEBS Letter, 579 , 5822 -5829(2005).
9) Ambros, V. : Nature, 431 , 350 - 355(2004).
10) Liu, J. et al. : Nature Cell Biol., 7, 1261- 1266(2005)
11) Liu, J. et al. : Science, 305 , 1437 - 1441(2004).
12) Carmell, M. A. et al. : Genes Dev., 16 , 2733 -2742(2002).
13) Yuan, Y-R. et al. : Mol. Cell, 19, 405- 419(2005).
14) Song, J-J. et al. : Science, 305, 1026- 1032(2004).
15) Miyoshi, K. et al. : Genes Dev., 19 , 2837 -2848(2005).
16) Saito, K. et al. : Genes Dev., Epub Aug 1(2006).

 

掲載されている試薬は、試験・研究の目的のみに使用されるものであり、「医薬品」、「食品」、「家庭用品」などとしては使用できません。
表示している希望納入価格は「本体価格のみ」で消費税等は含まれておりません。
表示している希望納入価格は本記事掲載時点の価格です。最新価格は「製品検索」からコードNo.で検索してご確認ください。

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