富士フイルム試薬 [Laboratory Chemicals]試薬 [Laboratory Chemicals]
製品カタログ 試験研究用試薬・抗体 請求
試薬ホーム > 製品情報 > ライフサイエンス > 遺伝子 > MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS Q&A

MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS

PS Capture™ Exosome ELISA Kit (Anti Mouse IgG POD)


MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS

キットの仕様、性能について

Q1:精製法の原理を教えてください

エクソソームを始めとする細胞外小胞(Extracellular Vesicles : EVs)の膜表面に存在するホスファチジルセリン(以下、PS)と 金属イオン依存的に PS に結合する Tim4 というタンパク質を利用してエクソソーム等の細胞外小胞を精製するキットです。
抗体を使わないアフィニティー精製法です。



Q2:どのような細胞外小胞が精製できますか

PS を脂質膜表面に露出しているエクソソームやマイクロベジクルを精製することができます。



Q3:エクソソームとマイクロベジクルの違いは何ですか

エクソソームとマイクロベジクルは生成されてくる経路で区別されています。
後期エンドソームから分泌される細胞外小胞をエクソソーム、細胞膜から直接出芽してくる細胞外小胞がマイクロベジクルと定義されています。
両者は大きさ分布が異なり、エクソソームは粒子径約 40 〜 100 nm 程度であり、マイクロベジクルは粒子径約 100 〜 1,000 nm 程度と言われますが、 もっと小さなマイクロベジクルも報告されてきており、大きさで明確に分かれるものではないようです。



Q4:エクソソームとマイクロベジクルを別々に精製できますか

上述したように大きさで明確に区別できないため完全に分けることはできませんが、 本キットでは、各々の主要な画分を得るために以下の簡便な分離方法を推奨しています。 エクソソームを始めとする粒子径が小さい細胞外小胞(small EVs)を精製する場合は、 10,000 × g で遠心分離した「上清」をサンプルとして用いてください。
マイクロベジクルを含む粒子径が大きい細胞外小胞(Large EVs)を精製する場合は、 まず 1,200 × g で遠心分離した上清を取得し、それを 10,000 × g で遠心分離して得られる「沈殿」を TBS に懸濁してサンプルとして用いてください。 また、両方を一緒に精製する場合は、1,200 × g で遠心分離した「上清」をサンプルとしてご使用ください。
サンプルの前処理条件の詳細は取扱説明書に記載しておりますのでご参照ください。



Q5:エクソソームやマイクロベジクル以外の物も取れてくることはありませんか

エンベロープを持つウイルスを回収してくることがわかっています。エンベロープ型のウイルスの膜表面にも PS が露出しているため、エンベロープ型ウイルスが混入しているサンプルでは、両方回収されてきます。この性質を利用してエンベロープ型ウイルスの回収に応用できる可能性があります。
分離したい場合は、本キットで回収後、ウイルスに特異的な抗体を用いたアフィニティー精製を行う必要があります。
以上の事に関しては、エンベロープ上に存在する CD63 などのエクソソームマーカーに対する抗体を使った精製法でも同様のことが言えます。



Q6:全てのエクソソームが PS を露出していますか

全てのエクソソームが PS を露出していることを示す知見は得られていません。エクソソームの膜脂質成分を解析した論文で用いられた何種類かの細胞(マウスオリゴデンドロサイトなど)由来のエクソソームにおいては存在が確かめられていますが、 PS を露出していない、または PS 露出量が少ないエクソソームが存在する可能性は否定できず、そのようなエクソソームは本キットでは回収できません。
和光純薬時報 Vol.85 No.1(2017.01)テクニカルレポート「新規アフィニティーエクソソーム精製法とエクソソーム高感度検出への応用」の図 4「各種細胞のエクソソームマーカータンパク質発現解析」にて、本キットで精製したエクソソーム 1ng あたりのエクソソームマーカー(CD9、CD63、CD81)検出結果を掲載しております。 細胞種によってマーカー発現量が異なりますのでシグナル強度にバラつきはありますが、ここで適用した 13 種類の細胞から培養上清中のエクソソームを精製できたことが示されております。
すべてのエクソソーム上に PS が露出している知見は得られていませんが、上記エクソソームマーカーは細胞種によって強弱に大きな差があるため、エクソソームの捕捉・精製に利用する方法としては本キットの PS アフィニティー法が優れていると考えています。



Q7:どのようなサンプルから精製できますか

細胞培養上清、血清、ヘパリン - 血漿、EDTA- 血漿、尿から回収した実績があります。
ただし、金属イオンを必要とする本法では、キレート剤(EDTA)処理血漿からエクソソームを回収する場合、限外ろ過等でバッファー交換をする必要があります。
その詳細なプロトコールは、製品ホームページをご参照ください。また、本キットのユーザー適用例として、髄液や唾液からのエクソソーム精製に使用してくださった方もいらっしゃいます。



Q8:1 回あたりのエクソソームの取得量はどれくらいですか

サンプルの種類や量により大きく異なりますが、弊社実績では 1 回の精製操作でタンパク質量にして約 30μg/mL 程度(BCA 法で測定)、粒子数にして 1 〜 2 × 1010/mL の粒子(NanoSight LM10 で測定)が取得できています(モネンシンナトリウムでエクソソーム分泌を亢進させた K562 培養上清 5 mL を 1 mL に濃縮してから精製操作を行った場合)。
また、健常人ヒトプール血清 1 mL から弊社実績で 1 回の精製操作でタンパク質量にして約 34μg/mL 程度(BCA 法で測定)、粒子数にして 5 × 109/mL 程度の粒子(NanoSight LM10 で測定)が取得できています。本キットは、最終 100μL の溶出液を得られます。



従来法との比較について

Q9:超遠心分離法と比べた場合の利点は何ですか

超遠心分離法よりも高純度なエクソソームを簡便に再現性良く高い効率で回収することができます。また、超遠心分離法では沈殿しにくいようなエクソソームを回収できることも確認しております。
回収されるエクソソームの純度も高く、超遠心分離法と密度勾配遠心法を組み合わせた場合と同等レベルの高純度なエクソソーム画分を取得することができます。



Q10:抗体を用いたアフィニティー法と比べた場合の利点は何ですか

抗体を用いたアフィニティー法は、エクソソーム表面抗原に対する抗体を用いているため変性剤による溶出や酸性条件下でエクソソームを解離させて回収する必要がありますが、本キットは、中性条件下でキレート剤を用いて溶出できるため、インタクトに近いエクソソームを回収することができます。変性剤を用いた溶出が必要ないため、ビーズに非特異吸着したタンパク質の混入が少なく、より高純度なエクソソームが取得できます。また、回収効率が高いことも確認しております。
1 種類のエクソソーム表面マーカータンパク質をターゲットとした従来の抗体アフィニティー法より、膜脂質成分をターゲットとした本キットはより広い範囲のエクソソームを取得できるものと考えられます。また、表面マーカータンパク質を認識する抗体は異なる動物種の抗原を認識しないケースもありますが、本キットは広い範囲の動物種で利用可能です(ヒト、マウス、ウシ、サルで実績があります)。



Q11:ポリマー沈殿法と比べた場合の利点は何ですか

ポリマー沈殿法より回収効率は低いですが、純度の高いエクソソームが取得できます。



キットの操作法、組成について

Q12:本キットの操作時間はどのくらいですか

サンプル前処理が約 1 時間(EDTA- 血漿 1 mL のバッファー交換を行う場合、約 3 〜 4 時間かかります。)、キット工程が 3 時間 30 分です。
工程の内訳は、Exosome Capture のビーズへの固定化が約 15 分間、サンプルとの反応が 3 時間、エクソソームの洗浄溶出が 約 35 分間です。
サンプルとの反応時間を 2 時間まで短縮することも可能ですが、実験結果に影響が無いことを事前にご確認ください。



Q13:本キットの操作で、特に慎重に行った方が良い操作は何ですか

@Exosome Capture 固定化ビーズとサンプルを反応させた後の洗浄ステップ最終段階で、洗浄液をしっかりと除去することです。
 完全に除去したことを確認後、溶出操作に入ってください。
A溶出ステップでビーズに溶出液を加えた後、ビーズが凝集していないか確認しながらしっかりと懸濁してください。



Q14:溶出液の組成は何ですか

1 mM のキレート剤、塩、防腐剤を含む Tris ベースの溶液です。これらの成分がその後の解析を阻害する可能性がある場合は、限外濾過(ザルトリウス社 VivaSpin500、分画分子量 100K、メーカーコード:VS0141)により、適切なバッファーに置換してください。



Q15:Exosome Capture を固定化した使用後の磁気ビーズのリサイクルは可能ですか

可能です。サンプル中のエクソソームを効率よく回収できるよう、使用した磁気ビーズを 4 回まで再生利用可能です。バッファー類も十分量同梱されていますので、同一サンプルからの繰り返し抽出やコンタミネーションしないケースの場合、最大 50 回使用可能な仕様となっています。
容量が 1 mL 以上のサンプルから回収を行う場合や濃縮サンプルから回収する場合にお勧めいたします。詳しくは取扱説明書をご参照ください。



Q16:Exosome Capture 固定化磁気ビーズの保存は可能ですか

可能です。エクソソームを溶出した後の Exosome Capture 固定化ビーズを再利用する場合は、キット添付の Washing buffer または自家調製した TBS(0.05% アジ化ナトリウムを含む)を用いて冷蔵保存してください。(弊社実績:3ヶ月経過後も使用可。)



Q17:実験操作を翌日まで持ち越せるステップはありますか

Exosome Capture 固定化ビーズとサンプルを反応させるステップ(反応時間 3 時間)は終夜で反応させても問題ありません。



サンプル量について

Q18:精製に用いるサンプルの最低必要量はどのくらいですか

安定的にビーズとサンプルを混合するために、ローテーターを用いて反応を行う場合は 500μL 以上、チューブミキサーを用いて反応を行う場合は 100μL 以上のサンプルを用いて下さい。
これより少ない量のサンプルを用いる場合は TBS を加えて最低必要量以上としてから Exosome Capture 固定化ビーズと反応させてください。



Q19::多量のサンプルから回収できますか

濃縮することにより対応できます。細胞培養上清の場合、50 mL までのサンプルに対応できます。遠心分離前処理済みの上清 50 mL を 1 mL まで限外濾過濃縮してください。(推奨フィルター:ザルトリウス社 VivaSpin20、分画分子量 100K、メーカーコード:VS2041)
無血清培地だけではなく 10%FBS 添加培地にも対応できます。詳しくは取扱説明書をご参照ください。
血清サンプルは濃縮できないため、使用できるのは 1 mL までです。



エクソソーム抽出後の解析について

Q20:エクソソームの中にはどのようなものが含まれていますか

タンパク質や脂質、核酸(DNA、microRNA、mRNA)などが含まれていることが報告されています。



Q21:精製した細胞外小胞は、どういった解析に使用できますか

インタクトな細胞外小胞が得られますので、あらゆる解析に利用できます。

(例)
・タンパク質解析:タンパク質電気泳動、ウェスタンブロット、MASS 解析、フローサイトメトリー、ELISA など
・核酸解析:qPCR、マイクロアレイ、次世代シークエンスなど
・粒子解析:電子顕微鏡解析、NanoSight 解析(NTA)など
・機能解析:in vitroin vivo での投与実験など



Q22:精製した細胞外小胞はそのまま細胞への添加実験に使えますか

2 mM EDTAを含むTBSバッファーを調製後、キット添付の溶出バッファーの代わりにご使用ください。溶出工程で得られたエクソソームサンプルについては遠心式フィルターユニット (Millipore 社 Ultrafree - MC, GV 0.22μm 滅菌済み、メーカーコード:UFC30GV0S)を用いて除菌処理を行った後、細胞添加実験等にご使用する事を推奨します。



Q23:電子顕微鏡解析に必要なエクソソーム量はどのくらいですか

当社の実績では 2〜4×1010の粒子(NanoSight LM10 で測定)を電子顕微鏡解析に用いました。



Q24:精製した細胞外小胞の保存はどうすれば良いですか

冷蔵または冷凍で保管してください。また長期間保存する場合は -80℃で保管してください。凍結保存する場合は凍結融解を避けるため、小分け保存することをお勧めします。



Q25:回収したエクソソーム抽出液からウェスタンブロット解析へ持って行きたいが、どうすれば良いですか

当社研究所では、回収した抽出液 100μL から 15μL をとり、5μL の 4 × SDS サンプルバッファーを加えて 20μL のサンプルに調製した後、SDS-PAGE に全量使用しています。
パンフレットに記載のウェスタンブロットのサンプル量も同条件で実施しています。



エクソソームマーカーについて

Q26:本キットで精製したエクソソームはどのように確認していますか

表面抗原に対する抗体を用いたウェスタンブロッティング、電子顕微鏡解析、密度勾配遠心分離法、粒子径測定(NanoSight LM10)などで確認しています。



Q27:エクソソーム精製後、ウェスタンブロットで確認しているマーカータンパク質は何ですか

CD9, CD63, CD81, Tsg101, Alix, Flotillin-2, Lamp-1 などです。



関連製品について

Q29:ウェスタンブロットで利用可能なエクソソームマーカー検出抗体は販売している か?

当社で使用実績のある下記抗体を販売しています。

Antigen Reactivity Antibody メーカー 用途
CD63 human 抗 CD63 マウスモノクローナル抗体(3-13) Wako, Code: 012-27063 WB、ELISA
CD81 human 抗 CD81 マウスモノクローナル抗体(1D6) Novus, Code:NB100-65805(Wako 559-30131 WB
human 抗 CD81 マウスモノクローナル抗体(M38) Novus, Code:NBP1-44861(Wako 550-30161 ELISA
TSG101 human 抗 Tsg101 マウスモノクローナル抗体(4A10) Novus, Code:NB200-112(Wako 553-30151 WB
Alix human 抗 Alix マウスモノクローナル抗体(3A9) Novus, Code:NB100-65678(Wako 552-30121 WB


Q29:精製した細胞外小胞から RNA を精製するキットは販売していますか

販売しています。microRNA Extractor® SP Kit(コード:295-71701)を利用することで、AGPC 法よりも効率よく microRNA とmRNA を精製することができます。



Q30:磁気スタンドは販売していますか

マグネットスタンド(コード:290-35591)を販売しています。


実験条件について

Q31:モネンシン酸ナトリウムの条件を教えてください

K562 細胞の培養で使用したモネンシン酸ナトリウムの終濃度は、10 μM です。モネンシン酸ナトリウムをエタノールで溶かして 10 mM に調製し、1/1000 量を培地に添加して使用しています。

参考論文
Exosome Release Is Regulated by a Calcium-dependent Mechanism in K562 Cells.
J Biol Chem., 2003 May 30, 278 (22), 20083-90.



Q32:ポジティブコントロールサンプルはどのように用意すれば良いですか

HEK293 や HEK293T のようなコントロール細胞を培養していただき、培養上清を 20 mL 程度ご用意ください。その後 1 mL に濃縮していただき、説明書にしたがってエクソソームを精製してください。CD9、CD63、CD81 のマーカーの発現が確認できます。
培養条件は、血清入り培地で一日培養後無血清培地に交換し、さらに 3 日間培養してください。



Q33:BCA アッセイのプロトコールを教えてください

以下のプロトコールを用いて、スタンダードの検量線を用意しています。タンパク質量はかなり薄いため、BCA の場合はサンプルを希釈せずに測定を実施してください。

@スタンダード BSA 溶液 250、125、62.5、31.25、15.625μg/mL およびスタンダード BLANK を 25μL ずつ 96 ウェルプレートに添加する。
Aエクソソーム精製品および Elution Buffer(BLANK)を 25μL ずつ 96 ウェルプレートに添加する。
B Protein Assay BCA Kit(コード:297-73101)の試薬 A と試薬 B の混合液(A:B=50:1)をサンプルの入ったウェルに 200μL 添加する。
C 60℃で 30 分間インキュベートする。
D室温でプレートを冷ます。
E吸光度 560nm を測定する。


トラブルについて

Q34:上手く精製できません。どのように用意すれば良いですか

Q32 を参考にポジティブコントロールをご用意ください。また、培地中の細胞外小胞量が少ない可能性があるので、培養スケールを大きくしてください。



PS Capture™ Exosome ELISA Kit (Anti Mouse IgG POD)


キットの仕様、性能について

Q1:標準品は必ず調製しなければいけませんか。その際 MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS をどうしても使わなければいけませんか

定量測定を行う場合、標準品として細胞外小胞を調製してください。超遠心法やポリマー沈殿法等の方法で精製した細胞外小胞も標準品として利用可能ですが、測定と同じ原理の PS アフィニティー法で精製した細胞外小胞を標準品として推奨しています。(調製方法の詳細はキット取扱説明書をご参照ください)。



Q2:なぜ標準品が添付されていないのですか

細胞ごとに分泌される細胞外小胞の表面マーカータンパク質の種類や量にばらつきがあるので、標準品と測定サンプルの由来細胞を同一にする必要があります。
そのためキットには標準品が添付されていませんので、サンプルと同一由来細胞の培養上清から精製した標準品を調製してください。



Q3:血清や血漿サンプルを直接測定できますか

キット添付の検出用二次抗体がヒト、マウス、ラット IgG に非特異反応を示すため、ヒト、マウス、ラットの血清や血漿検体を直接測定することは推奨しません。
ただし、血清や血漿検体から MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS を用いて精製した細胞外小胞をサンプルにした場合、定性解析できます。 また、超遠心法やポリマー沈殿法などにより精製した細胞外小胞も定性解析できます。



Q4:細胞培養上清サンプルを直接測定できますか

キット添付の一次抗体(抗 CD63 抗体)、二次抗体はウシ IgG に非特異反応しないため、無血清培地だけでなく FBS 添加培地の細胞培養上清も直接測定できます。
細胞培養上清サンプル中の細胞外小胞の定量解析や定性解析にご使用ください。



Q5:一次抗体は変えられますか

変更できます。検出したい表面マーカーに対するマウス抗体をお選びいただき、説明書に従って最適濃度をご検討ください。



Q6:残った試薬はどのように保管すれば良いですか

取扱説明書の【6. キットを分割使用する場合の各構成試薬の保存方法】をご参照ください。



従来法との比較について

Q7:他法より検出感度は高いですか

抗体を固相化した ELISA 法や、精製したサンプルを直接プレートに固定化する ELISA 法より高感度に細胞外小胞を検出できることを確認しています。また、ウェスタンブロット法と相関性があることも確認できています。



キットの操作法、組成について

Q8:本キットの操作時間はどのくらいですか

キット工程は約 5 時間です。工程の内訳は、希釈された細胞培養上清検体あるいは精製希釈した細胞外小胞サンプルのプレートへの固定化作業が 2 時間、一次抗体反応が 1 時間、二次抗体反応が 1 時間、TMB 反応が 30 分間です。その他洗浄作業を含めると、約 5 時間で測定が完了します。
Stop Solution を加えた後、450 nm と副波長 620 nm(600 〜 650 nm)の吸光度を測定してください。



Q9:Exosome Capture 96 Well Plate はリサイクルできますか

Stop Solution によりプレート上のタンパク質が変性するため、再生利用できません。



Q10:実験操作を翌日まで持ち越せるステップはありますか

各サンプルをプレートに固定化するステップを 4℃、終夜で反応させても問題ありません。



サンプル量について

Q11:検出に用いるサンプルの最低必要量はどのくらいですか

タンパク質量にして、1ng 相当の細胞外小胞があれば検出可能です。COLO201 細胞培養上清から精製した細胞外小胞の検出限界は、11 pg でした。(細胞株によって検出限界が変わることを確認しています。)



Q12:培養上清を直接測定する場合、どのくらいのサンプルが必要ですか

数μL (1 〜 5μL) 程度の培養上清があれば十分測定可能です。培地中の細胞外小胞量の経時変化を測定したい場合や新規の細胞培養上清サンプル中の解析を行う場合にお勧めです。
ただし、細胞種(iPS 細胞など)によっては培地中の細胞外小胞量が少ない場合もあるため、適宜サンプル量をご検討ください。サンプル中の細胞外小胞量が分からない場合、希釈せずに培養上清サンプル(100μL)を使用することをお勧めいたします。



関連製品について

Q13:お勧めの検出用一次抗体はありますか

以下の抗体は弊社で ELISA に使用できることを確認しています。

Antigen Reactivity Antibody メーカー 用途
CD63 human 抗 CD63 マウスモノクローナル抗体(3-13) Wako, Code: 012-27063 WB、ELISA
CD81 human 抗 CD81 マウスモノクローナル抗体(M38) Novus, Code:NBP1-44861
(Wako 550-30161
ELISA
CD9 Mouse 抗 CD9 ラットモノクローナル抗体(MZ3) Bio Legend, Code:124802 ELISA
CD63 Mouse 抗 CD63 ラットモノクローナル抗体(NVG-2) Bio Legend, Code:143902 ELISA
CD81 Mouse 抗 CD81 アルメニアンハムスターモノクローナル抗体(Eat-2) Bio Legend, Code:104902 ELISA

トラブルについて

Q14:上手く検出できません。どこを確認すれば良いですか

各試薬の有効期限が切れていないか確認してください。また、キット添付の Control Primary Antibody Anti CD63(100 ×)のシグナルも確認できていない場合は、CD63 の発現量が検出限界以下、または他の原因が考えられますので、当社までお問い合わせください。



富士フイルム和光純薬工業

本社〒540-8605大阪市中央区道修町三丁目1番2号       TEL 06-6203-3741(代表)
東京本店〒103-0023東京都中央区日本橋本町二丁目4番1号 TEL 03-3270-8571(代表)
●九州営業所 092-622-1005(代) ●中国営業所 082-285-6381(代) ●東海営業所 052-772-0788(代)
●藤沢営業所 0466-29-0351(代) ●筑波営業所 0298-58-2278(代) ●東北営業所 022-222-3072(代)
●北海道営業所 011-271-0285(代)
E-mail: ffwk-labchem-tec@fujifilm.com URL: http://www.wako-chem.co.jp
フリーダイヤル: 0120-052-099 フリーファックス: 0120-052-806