りん酸基アフィニティー電気泳動用試薬
Phos-tag^® Acrylamide

Phos-tag® Acrylamideをアクリルアミド溶液に混ぜて重合させるだけで、りん酸化タンパク質と非りん酸化タンパク質を分離するSDS-PAGEができます。 Phos-tag® 入りプレキャストゲル「スーパーセップTM Phos-tag® 」のご紹介はこちら。 　 特長 りん酸アフィニティー電気泳動法の原理 使用例：Ablによるりん酸化反応の経時的変化の観察 価格表 参考文献 ガイドブック Q&A Protocol　English

お試し包装が通常製品になりました！　

キャンペーンでご好評いただいた「Phos-tag^® Acrylamide お試し包装」が通常製品として登場！
はじめて Phos-tag^® Acrylamide を使う方におすすめです。ぜひ一度お試しください！

コードNo.	メーカーコード	品名	容量	希望納入価格（円）	備考
304-93526	AAL-107S1	5mM Phos-tag® Acrylamide AAL-107 水溶液	0.3 mL (0.9 mg相当)	15,000	5 mM 水溶液に調整済み

◆ ミニゲル約3〜7枚分(ゲルの大きさや、Phos-tag^® Acrylamide 濃度により異なります)

　

特長

• 同一レーンでタンパク質のりん酸化と非りん酸化を検出可能
• タンパク質のりん酸化と非りん酸化の経時的変化が観察可能
• Phos-tag^® の結合性はアミノ酸組成に依存しない
• 実験操作は通常のSDS-PAGEとほぼ同様

　

りん酸アフィニティー電気泳動法の原理

 

　

使用例：Ablによるりん酸化反応の経時的変化の観察

チロシンキナーゼAblの基質ペプチド(Abltide)とGSTの融合タンパク質を用い、ペプチドのチロシンがりん酸化される反応をりん酸アフィニティー電気泳動にて検出した。

通常のSDS-PAGE (CBB染色)

Phos-tag^® SDS-PAGE (CBB染色)

 

通常のSDS-PAGE(上図：Phos-tag^® 非存在下)では、基質がりん酸化されていることは全く確認できない。
一方、Phos-tag^® SDS-PAGE (下図：100 μM Phos-tag^® )においては、りん酸化反応の進行に伴って泳動が遅れるバンドが出現し、それと対照的に泳動の速いバンドが減少した。

　

価格表

コードNo.	メーカーコード	品名	容量	希望納入価格（円）	備考
304-93526	AAL-107S1	5mM Phos-tag® Acrylamide AAL-107 水溶液	0.3 mL (0.9 mg相当)	15,000	5 mM 水溶液に調整済み
304-93521	AAL-107	Phos-tag® Acrylamide AAL-107	10 mg	60,000
300-93523	AAL-107M		2 mg	25,000

＊本キットは体外診断用ではありません。
＊希望納入価格には消費税等が含まれておりません。

Phos-tag^® PAGEガイドブック

Phos-tag^® PAGE　ガイドブックを作成しました！(2012.5月発行、B5サイズ)

りん酸化研究の新ツール「Phos-tag^® Acrylamide」の条件検討方法、トラブルシューティング、Q&Aなどを記載。

「最適条件の決定が難しい！」、「使うとどんなメリットがあるの？」、「通常のSDS-PAGE との違いは？」、「ウエスタンブロッティングに使うには？」
すでに使用いただいているお客様にご協力いただき、Phos-tag^® Acrylamide の魅力とその使い方を１冊のガイドブックにまとめました。

ガイドブックPDFファイル (1.6MB) 　

 

＜目次＞

1. 原理と使用例
   
2. Phos-tag^® Acrylamide とは？
3. プロトコール
   
4. トラブルシューティング
   
5. Phos-tag^® SDS-PAGE の条件検討
   
6. アプリケーションデータと参考文献
   
7. スーパーセップPhos-tag^®
   
8. Ｑ＆Ａ（Phos-tag^®シリーズ）
9. Phos-tag^®シリーズ
10. 関連製品(電気泳動/ウエスタンブロッティング)

参考文献

1. "Phosphate-binding tag, a new tool to visualize phosphorylated proteins", E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, K. Takiyama, and T. Koike, Mol. Cell. Proteomics, 2006, 5, 749-757.
2. "Phos-tagを用いたりん酸化タンパク質の検出法　�Aアクリルアミド化Phos-tagを用いたりん酸アフィニティー電気泳動", 木下恵美子, 木下英司, 小池透, 実験医学, 2006, 24, 2649-2654.
3. "A single nucleotide polymorphism genotyping method using phosphate-affinity polyacrylamide gel electrophoresis", E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, and T. Koike, Anal. Biochem., 2007, 361, 294-298.
4. "Label-free kinase profiling using phosphate affinity polyacrylamide gel electrophoresis", E. Kinoshita-Kikuta, Y. Aoki, E. Kinoshita, and T. Koike, Mol. Cell. Proteomics, 2007, 6, 356-366.
5. "りん酸基アフィニティー電気泳動法を利用した細胞内タンパク質りん酸化反応の解析法", 木下英司, 木下恵美子, 小池透, 実験医学, 2007, 25, 1229-1235.
6. "りん酸基アフィニティー電気泳動法を利用した遺伝子診断法", 木下英司, 木下恵美子, 小池透, 実験医学, 2007, 25, 3033-3039.
7. "Separation of a phosphorylated-His protein using phosphate-affinity polyacrylamide gel", S. Yamada, H. Nalkamura, E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, T. Koike, and Y. Shiro, Anal. Biochem., 2007, 360, 160-162.
8. "A mobility-shift detection method for DNA methylation analysis using phosphate-affinity polyacrylamide gel electrophoresis", E. Kinoshita-Kikuta, E. Kinoshita, and T. Koike, Anal. Biochem., 2008, 378, 102-104.
9. "Separation of phosphoprotein isotypes having the same number of phosphate groups using phosphate-affinity SDS-PAGE", E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, M. Matsubara, S. Yamada, H. Nakamura, Y. Shiro, Y. Aoki, K. Okita, and T. Koike, Proteomics, 2008, 8, 2994-3003.
10. "FANCI phosphorylation functions as a molecular switch to turn on the Fanconi anemia pathway", M. Ishiai, H. Kitao, A. Smogorzewska, J. Tomida, A. Kinomura, E. Uchida, A. Saberi, E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, T. Koike, S. Tashiro, S. J. Elledge, and M. Takata, Nature Struct. Mol. Biol., 2008, 15, 1138-1146.
11. "Two-dimensional phosphate affinity gel electrophoresis for the analysis of phosphoprotein isotypes", E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, M. Matsubara, Y. Aoki, S. Ohie, Y. Mouri, and T. Koike, Electrophoresis, 2009, 30,550-559.
12. "Phosphate-affinity Gel Electrophoresis Using a Phos-tag Molecule for Phosphoproteome Study", E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, and T. Koike, Current Proteomics, 2009 ,6,104-121.
13. "Mobility shift detection of phosphorylation on large proteins using a Phos-tag SDS-PAGE gel strengthened with agarose", E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, H. Ujihara, and T. Koike, Proteomics, 2009 ,9,4098-4101.
14. "Separation and detection of large phosphoproteins by using Phos-tag SDS-PAGE", E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, and T. Koike, Nature Protocols, 2009,4,1513-1521.

　

Q&A

Q.MnCl₂の濃度は Phos-tag^® Acrylamide の濃度に合わせて変える必要があるのか？

A.原則としてMnCl₂は Phos-tag^® Acrylamide の2等量（モル比）を加えてください。1分子の Phos-tag^® に対して2分子のMn²⁺が結合するためです。
（例. 20uM Phos-tag^®の場合 ：40uM MnCl₂、100uM Phos-tag^®の場合 ：200uM MnCl₂）。

　

Q.Phos-tag^® SDS-PAGE 後、ウエスタンブロッティングを行いたいが、メンブレンへの転写効率が悪い。どうしたらよいか？

A.転写の前に行うEDTA入り転写バッファー処理について、「EDTA濃度を上げる」、「EDTA入り転写バッファー交換回数を増やす」などの条件検討をしてください（例. 10mM EDTA、5〜10分×3〜4回）。

　

Q.りん酸化タンパク質の定量は可能か？

A.定量性のある染色剤 (CBB など) により、バンドの濃さから定量することができます。

　

Q.何kDa までのタンパク質を分離できるのか？

A.350 kDa のりん酸化タンパク質の分離実績があります。（20uM Phos-tag^®、3% アクリルアミド ＋ 0.5 % アガロース)

文献： Proteomics, 9, 4098-4101 (2009), E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, H. Uchijima, and K. Koike 　

　

Q.ゲルの銀染色や蛍光染色は可能か？

A.可能です。

　

Q.使用回数は？

A.Phos-tag^® Acrylamide の使用濃度によって異なります。

　20uM:約100枚、50uM:約40枚、100uM:約20枚　(10mg包装、9cm×7.7cm×1mmゲルの場合)。

　

Q.Phos-tag^® Acrylamide 入りゲルは作製後、保存可能か？

A.保存はできません。ゲルは調製後、その日のうちにご使用下さい。

　

Q.methanol と蒸留水に溶解した後、どのくらい保存可能か？

A.冷蔵・遮光で6 ヶ月間は問題ありません。

　

Q.Phos-tag^® Acrylamide をプロトコール通りに溶解したら白濁した。大丈夫か？

A.大丈夫です。白濁するのはmethanol の影響で、一時的なものです。

　

Q.Phos-tag^® Acrylamide を蒸留水のみでの溶解は可能か？

A.可能です。ただし、methanol を加える場合に比べて溶解に時間がかかります。完全に溶解しないときは遠心し、上清 を使用して下さい。

　

Q.分子量マーカーは何を使えばよいのか？

A.マーカーは不要です。Phos-tag^® SDS-PAGE の移動度は、りん酸化の影響を受けるため、分子量を決定することはで きません。マーカーのかわりにりん酸化のネガティブコントロール（例．アルカリフォスファターゼ処理したサンプル、 大腸菌などで作製した目的タンパク質の組換え体）を使用することをお奨めいたします。

　

Q.りん酸化反応液中の ATP は電気泳動に影響を与えるのか？

A. 2.0 mM ATP では、特に影響はありませんでした。限界量は未調査です。

　

Q.サンプル溶液に混ぜるなどしてプレキャストゲルに使うことはできるのか？

A.できません。 Phos-tag^® 入りプレキャストゲル「スーパーセップ^TM Phos-tag^®」 をご検討ください。

　

Q.Phos-tag^® SDS-PAGE でバンドシフトが見られたが、りん酸化なのか、目的タンパク質が分解されているだけなのか を区別する方法は？

A.通常のSDS-PAGE（Phos-tag^® なし） も行い、目的タンパク質が分解されていないことを確認して下さい。

　

Q. DNA の分離に使用できるのか？

A. 次の文献をご参照下さい。

・"A SNP genotyping method using phosphate-affinity polyacrylamide gel electrophoresis", Analytical Biochemistry, 361, 294-298 (2007), E. Kinoshita, E.Kinoshita-Kikuta, and T. Koike (The phosphate group at DNA-terminal is efficiently captured by Zn²⁺-Phos-tag.)

・"A mobility shift detection method for DNA methylation analysis using phosphate affinity polyacrylamide gel electrophoresis", Analytical Biochemistry, 378, 102-104 (2008), E. Kinoshita-Kikuta, E. Kinoshita, and T. Koike

　

掲載されている試薬は、試験・研究の目的のみに使用されるものであり、「医薬品」、「食品」、「家庭用品」などとしては使用できません。 表示している希望納入価格は「本体価格のみ」で消費税等は含まれておりません。 表示している希望納入価格は本記事掲載時点の価格です。最新価格は「製品検索」からコードNo.で検索してご確認ください。