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> 遺伝子 > Apoptosis in situ Detection KitのQ&A
Q. PBSは、予めどのくらい調製すればよいですか。
― A ―
パラフィン包埋切片の場合、PBSの洗浄操作は、計12回あります。また、DNaseⅠによる陽性コントロールの反応を行うと計14回になります。余裕を持って、2,000mlぐらい調製しておくことをお奨めします。
Q. 1回の反応で検出できる切片の大きさはどのくらいですか。
― A ―
1cm2以下の切片が理想ですが、最大では約2cm2の切片を処理することができます。
Q. DAB溶液に沈澱が生じているのですが、発色に影響はないでしょうか。
― A ―
多少沈殿が生じているだけでは問題ありません。上清を使用して下さい。開封後は、なるべく超低温(-80℃)に保存してください。
Q. POD標識抗体の免疫動物は何ですか。
― A ―
ヒツジです。
Q. 発色後の脱水処理は、エタノールとn-ブタノールどちらがよいのでしょうか。
― A ―
n-ブタノールの方が色彩鮮やかに染まります。
Q. メチルグリーン溶液は販売していますか。
― A ―
遺伝子研究用のメチルグリーン溶液を販売しています。
(Code.No 138-12701 メチルグリーン溶液 (0.5 w/v%) 100mL)となってます。
Q. バックグラウンドが高いのですが。
― A ―
POD標識抗体反応の前にブロッキング反応を行って下さい。
1% ヒツジ血清/5% BSA/0.1% Tween20/3M NaCl/10mMりん酸Buffer(pH7.4)を調製し、室温で約1時間反応後、PBSで5分間、3回洗浄して抗体反応に移って下さい。組織の状態や種類などによりますが、バックグラウンドが下がる場合があります。
Q. 検体として培養細胞を用いたのですが、DNaseⅠ処理しても全くシグナルが観察できなかったのですが。
― A ―
筋組織由来の培養細胞など細胞の種類により浸透化処理だけでは不十分な場合があります。その場合、浸透化処理後にタンパク質分解酵素処理(例えば37℃、5分)を行って下さい。
Q. シグナルがでないのですが。
― A ―
シグナルがでない理由として、DNAの切断を生じるアポトーシスが生じていない場合と反応がうまくいっていないため検出できない場合の2つが考えられます。その場合、DNaseⅠにより陽性コントロールを同時に行うことで判定することができます。
陽性コントロールにシグナルが検出され、標準検体にシグナルがでない場合は、DNA切断を伴なうアポトーシスが生じていない場合が考えられます。
陽性コントロールにもシグナルが確認されない場合は、反応がうまくいっていない場合が考えられます。 その場合、タンパク質分解時間を長くするか、分解酵素の添加量を多くすることも効果的な場合があります。
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