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銀染色キット ワコーに関するＱ＆Ａ

Q1 : マーカータンパク質も全く染まらない。
A1 : 以下の項目について確認して下さい。
  1. 説明書通りに試薬を調製したか再度確認して下さい。特に、自調製する「固定液-1」の組成を確認して下さい。
  2. ゲルのサイズを確認して下さい。和光のキットは14cm×14cm×1mm厚，濃度6〜15%ポリアクリルアミドゲルを基準にしています。2mm厚のゲルの場合、試薬濃度を2倍にして染色する必要があります。なるべく薄いゲルを選ぶことをお奨めします。感度や定量性ともに比較的よくなります。
  3. 銀染色は化学反応であるため、気温が20℃以下になると染色が著しく低下します。染色液および現像液は、必ず30〜40℃に加温して使用して下さい。特に、冬場の染色時には注意して下さい。
  4. 以上の操作でもバンドを確認することができなければ、固定-1の固定時間を一晩に延長して下さい。もし、これでも染まらない場合は、固定液を10%TCA(トリクロロ酢酸)を使用し、一晩固定操作を行って下さい。
Q2 : マーカータンパク質は染まるが、サンプルが染まらない。
A2 : 以下の項目について確認して下さい。
  1. タンパク質の種類により染まりが悪い場合があります。特に、糖タンパク質の場合通常の操作では染まりが悪い場合があります。糖タンパク質の場合、最初の固定-1、-2の操作の代わりに、4℃の0.2%過ヨウ素酸にゲルを浸して浸透し、糖タンパク質を酸化させた後、増感処理以下の操作を行うとよいという報告があります。
    参考文献 : 朝賀宏昭、田村真弓、山崎仁也、井上勤 : 「銀染色によるタンパク質・糖タンパク質の高感度検出法」,生物物理化学, 31, 106(1987)
  2. 固定-1の固定時間(15分間)を一晩に延長して下さい。もし、これでも染まらない場合は、固定液を10% TCA(トリクロロ酢酸)を使用し、一晩固定操作を行った後、固定-2の操作から行って下さい。
Q3 : バンドが白抜けしてしまう。
A3 : タンパク質のアプライ量が多い場合に白抜けする場合があります。アプライするタンパク質量を検討して下さい。一般的には、1バンドであれば、5〜20ng/ウエル、多数のタンパク質が混入している場合は、2〜4μg/ウエルぐらいを目安にアプライして下さい。
Q4 : ゲルが銀鏡する。
A4 : 水洗が不十分である場合によく起こります。水洗の回数を増やすか、振とう時間を延長して下さい。また、振とう器による振とうがしっかり行われているかを確認して下さい。
Q5 : バックグラウンドが高い。
A5 : 下記の項目について確認して下さい。
  1. 試薬由来の不純物などの混入が考えられますので、できるだけ高純度の試薬を使用することをお奨めします。また、水も再蒸留水を使用して下さい。
  2. 等電点電気泳動の場合は、合成担体(アンホラインなど)自体、銀染色で染色されるアミノ基を持っているためバックグランドが上がる原因となります。
Q6 : 偽バンドがでる。
A6 : 下記の項目について確認して下さい。
  1. 銀染色は、CBB染色に比べ　50〜100倍高感度であるため、少しのコンタミでも検出してしまいます。試薬の調製や特にガラス板でのゲルの作製には手袋を着用して行って下さい。
  2. 試薬のSDS中に不純物が混入している場合がありますので、高純度の試薬を使用することをお奨めします。
  3. 還元剤である2-メルカプトエタノールやDTTなど試料処理の際、多量に用いると60〜70KDa付近に偽バンドがでる場合があるという報告があります。
    4. 参考文献 : 朝賀宏昭、田村真弓、山崎仁也、井上勤 : 「銀染色によるタンパク質・糖タンパク質の高感度検出法」,生物物理化学, 31, 106(1987)
Q7 : 核酸の銀染色の方法は。
A7 : 銀染色キットIIのプロトコールを一部変更することで核酸を染色することができます。「固定液-1(10%トリクロロ酢酸200ml)」で10分間処理した後、「固定液-2(メタノール95ml／増感原液10ml／再蒸留水95ml)」で10分間処理し、水洗5分後、以下はキットの染色からの操作を行って下さい。もし、この操作でも検出できなければ固定-1の操作を一晩行って下さい。
Q8 : 銀染色後のDNAのバンドを回収する方法は。
A8 : 回収したいDNAのバンドをカッターナイフなどで切り出し、蒸留水(1.5ml)の入ったチューブ内に入れ洗浄した後、メスなどで約1/2〜1/8に切断し、PCR用の小さなチューブに移し、さらにピペットの先端で細断化し回収します。その後、PCRを行う場合は、細断化したゲルの入ったチューブにPCR反応液を加えてPCRを行って下さい。
Q9 : ゲルが膨潤してしまった。
A9 : 3.5%のような非常に薄い濃度のゲルを使用した場合生じる場合があります。水洗時の水の温度を室温にして下さい。40℃ぐらいにするとゲルが膨潤することがあります。
Q10 : アガロ−スでも染色できますか。
A10 : できますが、アガロ−スは、硫酸基を含んでいるため、バックグラウンドが上がります。もし、銀染色を行う場合は、硫酸含量の低いアガロ−スを使用することをお奨めします。

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